李 超，劉云華，劉玉紅，黃志芳，陳 燕，易進海*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室，四川 成都 610041）

川芎揮發(fā)油為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.根莖中的重要有效部位之一，其主要成分為苯酞內(nèi)酯類化合物，以高含量的藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 為代表［1］，臨床上常用于治療偏頭痛、心腦血管疾病等［2-4］，但由于苯酞類成分穩(wěn)定性、水溶性、生物利用度差，大大限制了其臨床應(yīng)用。

β-環(huán)糊精、羥丙基-β-環(huán)糊精是目前中藥制劑中應(yīng)用最廣泛的包合材料，具有較好的溶解性、安全性、穩(wěn)定性，還可在一定程度上提升生物利用度。鐘應(yīng)淮等［5］發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯等苯酞類成分在大鼠體內(nèi)存在較強的首過效應(yīng)，制成β-環(huán)糊精包合物后其生物利用度增加了2.2 倍。周成梁等［6］報道，藁本內(nèi)酯生物利用度差，經(jīng)β-環(huán)糊精包合后可增加2.7 倍。

研究藥物穩(wěn)定性、預(yù)測有效期是保證制劑質(zhì)量和臨床療效的關(guān)鍵。目前，關(guān)于揮發(fā)油包合物的研究大多涉及包合方法的篩選、工藝參數(shù)的優(yōu)化，以損失量少、包合率高為目的，但揮發(fā)油成分在包合物中的穩(wěn)定性鮮有報道。藁本內(nèi)酯極不穩(wěn)定，溫度是影響其穩(wěn)定性的首要因素［7-8］，本實驗采用經(jīng)典恒溫加速試驗對川芎揮發(fā)油環(huán)糊精包合物進行熱穩(wěn)定性研究，依據(jù)阿倫尼烏斯方程的熱降解動力學(xué)原理進行有效期預(yù)測，篩選其種類、質(zhì)量比，以期解決川芎揮發(fā)油及其相關(guān)制劑的穩(wěn)定性難題。

1 材料

1.1 儀器 DNP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）； ZKF035 型電熱真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）； XY3000-2C 型電子天平（上海巍鑫電子商務(wù)有限公司）； SECURA225D-1CN 型分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器 （北京） 有限公司］； Milli-Q Integral 3 型超純水機（美國Millipore 公司）； HSY2-SP 型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）； C-MAGHS7 型加熱磁力攪拌器（德國IKA 公司）； Sorvall LYNX 4000 型高速離心機（美國Thermo 公司）； SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； Rotavapor R-220SE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）； KQ-300E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

1.2 試劑與藥物 川芎揮發(fā)油（實驗室自制，藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 含量分別為48.18%、16.96%）。羥丙基-β-環(huán)糊精（批號HP20211025）、β-環(huán)糊精（批號20220625）（山東濱州智源生物科技有限公司）。丁苯酞對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號101035-202104）。甲醇為色譜純； 石油醚（60～90 ℃） 等其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備 采用課題組前期建立的單相法［9］。分別按質(zhì)量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15稱取羥丙基-β-環(huán)糊精，溶于3 倍量95%乙醇中，加入川芎揮發(fā)油混合均勻，回收乙醇，在65 ℃下真空干燥，粉碎，過80 目篩，即得。

2.2 β-環(huán)糊精包合物制備 以飽和水溶液法為基礎(chǔ)，進一步優(yōu)化后采用超聲攪拌法［10］。分別按質(zhì)量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 稱取β-環(huán)糊精，溶于10 倍量蒸餾水中，在超聲攪拌條件下將川芎揮發(fā)油（用等量95%乙醇稀釋） 緩慢滴加到β-環(huán)糊精溶液中，混合均勻，磁力攪拌（溫度55 ℃，轉(zhuǎn)速750 r/min） 30 min，冷卻至室溫，在4 ℃下冷藏24 h，離心（8 000 r/min、25 ℃） 10 min，底部沉淀在65 ℃下減壓干燥，粉碎，過80 目篩，即得。

2.3 有效成分含量測定 由于藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 對照品不穩(wěn)定，故2020 年版《中國藥典》 尚未收載兩者含量測定方法。本實驗采用課題組前期報道的一測多評法［11］，以丁苯酞為內(nèi)標，同時測定藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 含量，后兩者相對校正因子分別為0.226 3、0.490 7。

2.3.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水（52 ∶48）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長280 nm； 進樣量5 μL。理論塔板數(shù)按丁苯酞計，應(yīng)不低于3 000［11］。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取丁苯酞對照品適量，甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL 含178.3 μg 該成分的溶液，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取包合物粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz） 處理30 min，放冷，70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 包合率測定 參考文獻［10］ 報道，采用70% 乙醇超聲提取測得包合物總藥量； 石油醚超聲洗滌2 次，合并濾液和洗液，減壓回收石油醚，95% 乙醇溶解，測得未包合藥量，計算包合率，公式為包合率＝ ［（包合物中該成分總量-未包合該成分量） /包合物中該成分總量］ ×100%，結(jié)果見圖1～2。由此可知，洋川芎內(nèi)酯A 包合效果優(yōu)于藁本內(nèi)酯； 隨著羥丙基-β-環(huán)糊精用量增加，包合率明顯升高； 質(zhì)量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 的β-環(huán)糊精包合率無明顯差異，但為1 ∶4、1 ∶6 時顯著降低，分別僅為53%、82%，與文獻［12-13］ 報道一致，其原因是隨著β-環(huán)糊精用量增加，它所提供的分子空腔數(shù)由最初的不足逐漸變?yōu)檫^量，從而包合率不會持續(xù)升高，同時該現(xiàn)象還可能與羥丙基-β-環(huán)糊精包合類型為AL型，β-環(huán)糊精包合類型為AN型有關(guān)［14-15］。

圖1 不同比例羥丙基-β-環(huán)糊精對包合率的影響

圖2 不同比例β-環(huán)糊精對包合率的影響

2.5 經(jīng)典恒溫加速試驗 預(yù)試驗顯示，包合物中藁本內(nèi)酯在高溫條件下的降解速率顯著大于洋川芎內(nèi)酯A，對熱更不穩(wěn)定，故本實驗選擇藁本內(nèi)酯作為指標成分進行熱穩(wěn)定性考察。分別精密稱取質(zhì)量比1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶15 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物各4 份，裝入干燥潔凈的稱量瓶中（高約5 mm），密封，分別置于60、70、80、90 ℃恒溫烘箱中； 另取相同質(zhì)量比β-環(huán)糊精包合物，分別置于80、90、100、110 ℃恒溫烘箱中，于設(shè)計時間點取出，在冰水浴中迅速冷卻以終止反應(yīng)，取樣，根據(jù)減失質(zhì)量測定含量，按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表1～2。

表1 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物中藁本內(nèi)酯經(jīng)典恒溫試驗結(jié)果

表2 β-環(huán)糊精包合物中藁本內(nèi)酯經(jīng)典恒溫試驗結(jié)果

2.5.1 反應(yīng)級數(shù)確定 采用Excel 2019 軟件將包合物中藁本內(nèi)酯相對濃度（保留量） （C） 的對數(shù)lgC與任一溫度下時間t進行線性回歸（以lgC為Y軸，t為X軸），結(jié)果見表3～4。由此可知，r均大于0.99，表明線性關(guān)系顯著，一級動力學(xué)方程擬合較好，即羥丙基-β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精包合物中藁本內(nèi)酯降解均遵循一級動力學(xué)過程。

表3 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物中藁本內(nèi)酯在不同溫度下的降解反應(yīng)方程

表4 β-環(huán)糊精包合物中藁本內(nèi)酯在不同溫度下的降解反應(yīng)方程

2.5.2 反應(yīng)速率常數(shù)確定 一級動力學(xué)方程為lgC＝- （K/2.303）t＋lgC0，斜率為K/2.303，其中K為根據(jù)一級動力學(xué)降解反應(yīng)擬合所得包合物在不同溫度下的降解速度常數(shù)，結(jié)果見表3～4。

2.5.3 有效期預(yù)測 根據(jù)Arrhenius 方程，以4 個溫度下降解速度常數(shù)的對數(shù)lgK對絕對溫度的倒數(shù)1/T進行線性回歸［16-17］，結(jié)果見圖3～4、表5 ～6，可知各方程線性關(guān)系均顯著。Arrhenius 方程指數(shù)定律為lgk＝-E/2.303RT＋lgA［T為絕對溫度，斜率為-E/2.303R，A為頻率因子，E為反應(yīng)活化能，R為理想氣體常數(shù)（8.314 J/mol）］，將25 ℃（T＝298.2 K） 代入上述方程，測得不同質(zhì)量比包合物在室溫下的降解速度常數(shù)K25℃，以藁本內(nèi)酯含量降低至初始含量90%的有效期t0.9進行計算（t0.9＝0.105 4/K25℃），結(jié)果見表5～6。另外，各包合物降解反應(yīng)活化能E均在41.84～125.52 kJ/mol 范圍內(nèi)，即適用于Arrhenius 指數(shù)定律進行有效期預(yù)測，為了使其穩(wěn)定性滿足藥物有效期要求，而且環(huán)糊精用量小，生產(chǎn)成本低，最終確定為質(zhì)量比1 ∶8 β-環(huán)糊精包合物。

表5 羥丙基-β-環(huán)糊精包合物經(jīng)典恒溫有效期測定結(jié)果

表6 β-環(huán)糊精包合物經(jīng)典恒溫有效期測定結(jié)果

圖3 不同比例羥丙基-β-環(huán)糊精線性回歸曲線

圖4 不同比例β-環(huán)糊精線性回歸曲線

3 討論

研究表明，川芎揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性與環(huán)糊精用量呈正相關(guān)，并且在一定范圍內(nèi)包合率也與環(huán)糊精用量呈正相關(guān)，其原因是環(huán)糊精量較少時，所提供的分子空腔不足以滿足需求，而隨著其用量增多分子腔逐漸過量，包合狀態(tài)達到飽和［12-13］。另外，室溫下羥丙基-β-環(huán)糊精包合物有效期均較短（＜18 個月），難以滿足藥物穩(wěn)定性要求，而β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性顯著更優(yōu)，其中質(zhì)量比為1 ∶8 時有效期長達4 年。

包合物的穩(wěn)定性不僅與包合率相關(guān)，而且與包合物主-客體結(jié)構(gòu)特征也有密切關(guān)聯(lián)。前期報道，由于β-環(huán)糊精分子腔疏水作用力的存在［18］，藁本內(nèi)酯中極性較小的3-丁烯基先進入其空腔內(nèi)部，而極性較大的羰基、不穩(wěn)定的6，7-碳碳雙鍵位于其端口，前者可與端口上的羥基形成分子間氫鍵［19］，后者則可通過與端口羥基的分子間相互作用來增加鍵合強度，從而加強該成分穩(wěn)定性； 羥丙基-β-環(huán)糊精由于引入了親水性的羥丙基取代基［20］，導(dǎo)致其分子空腔的疏水作用力減弱［21］，還產(chǎn)生了明顯的空間位阻效應(yīng)［22］，使得主-客體間相互作用力減弱，同時羥丙基取代基還可形成分子內(nèi)自包結(jié)配合物［23-24］，從而降低其對客分子的鍵合能力，故川芎揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性顯著優(yōu)于羥丙基-β-環(huán)糊精包合物。上述結(jié)果對川芎揮發(fā)油包合物有效期的準確預(yù)測，以及其質(zhì)量穩(wěn)定可控和相關(guān)制劑開發(fā)具有重要意義。