侯建忠，朱順娟，李 瑤，王小鵬，郝建明，曹云飛

（1.酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 酒泉 735008； 2.酒泉市中醫(yī)院，甘肅 酒泉 735008； 3.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

川楝子為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.etZucc.的干燥成熟果實(shí)，具有舒肝、行氣止痛、驅(qū)蟲的功效，用于治療胸脅、脘腹脹痛、疝痛、蟲積腹痛［1］。小茴香為傘形科植物茴香Foeniculum vulgareMill.的干燥成熟果實(shí)，具有散寒止痛、理氣和胃的功效，用于治療寒疝腹痛、睪丸偏墜、脘腹脹痛［1］。鹽川楝子鎮(zhèn)痛抗炎作用顯著［2-3］，而鹽小茴香可暖腎散寒止痛［4］，兩者合用寒熱兼施，用于治療寒疝睪丸墜痛、婦女經(jīng)行腹脹、小腹冷痛［5-6］。藥理實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐都已證實(shí)，川楝子的治療量與中毒量非常接近［7-8］，因此，臨床上通常通過炮制和配伍的方式達(dá)到減毒增效的目的。鹽川楝子-鹽小茴香作為臨床治療寒疝睪丸墜痛的常用藥對，其化學(xué)成分在不同配伍比例及炮制前后必然存在著一定的量變或質(zhì)變，但目前缺乏相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同配伍比例和炮制方法下川楝子-小茴香藥對中9 種成分含量的變化，探討其最佳比例，以期為臨床安全有效地使用上述中藥飲片提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； DFT-200 型手提式高速中藥粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）； TLC PLATE HEATER Ⅲ型加熱板（瑞士Camag 公司）； XPE205DR 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KH-250DB 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

蘆丁 （批號100080-201610，純度91.9%）、阿魏酸（批號110773-201614，純度99.0%）、川楝素（批號111842-201804，純度96.9%）、反式茴香腦 （批號111835-201503）、α-蒎烯 （批號897-20001） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 槲皮素（批號22051613，純度98%）、異槲皮素（批號TC0693-220808，純度98%）、異川楝素（批號TC0385-221015，純度98%）、山柰酚（批號TC0655-220722，純度98%） 對照品均購自四川精粹天成藥物科技有限公司。乙腈（色譜純，德國默克公司）； 磷酸（分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）； 水為純凈水。

川楝子（批號2207001，產(chǎn)地四川）、小茴香（批號20200730，產(chǎn)地甘肅） 飲片均購自酒泉市中醫(yī)院，經(jīng)酒泉市中醫(yī)院郝建明主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 制備方法見表1。分別精密稱取各樣品2 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz） 提取2 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

表1 制備方法Tab.1 Preparation methods

2.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，甲醇制成一定質(zhì)量濃度的母液，混合，制成每1 mL分別含蘆丁8.608 μg、阿魏酸9.624 μg、槲皮素7.536 μg、山柰酚7.560 μg、異槲皮素8.448 μg、川楝素113.292 μg、異川楝素10.811 μg、α-蒎烯721.500 μg、反式茴香腦499.6 μg 的溶液，即得。

2.3 色譜條件 ZORBAX SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0 ～8 min，83% ～75% B； 8 ～17 min，75% ～66% B； 17 ～35 min，66% ～58% B；35～46 min，58% ～75%B； 46 ～60 min，75% ～83%B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長322 nm （0 ～5 min）、210 nm （5.1 ～38 min）、280 nm （38.1～60 min）； 進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.2” 項(xiàng)下對照品溶液2、5、10、15、20、25、30 μL，在 “2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，并以信噪比（S/N） ＝3 為檢測限，S/N ＝10 為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得蘆丁、異槲皮素、阿魏酸、槲皮素、異川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香腦峰面積RSD分別為0.08%、0.10%、0.13%、1.13%、0.99%、1.22%、0.06%、1.14%、0.95%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取生品川楝子-小茴香（1 ∶1）適量，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁、異槲皮素、阿魏酸、槲皮素、異川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香腦峰面積RSD 分別為1.32%、1.09%、1.11%、0.75%、0.84%、0.93%、1.92%、2.27%、2.04%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取生品川楝子-小茴香（1 ∶1）適量，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、8、16、24、32 h 在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得蘆丁、異槲皮素、阿魏酸、槲皮素、異川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香腦峰面積 RSD 分別為 2.17%、1.56%、1.55%、1.38%、2.07%、2.31%、2.14%、2.81%、1.06%，表明溶液在32 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的生品川楝子-小茴香（1 ∶1） 6 份，每份約1 g，精密稱定，按1 ∶1 比例精密加入各對照品適量，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，蘆丁、異槲皮素、阿魏酸、槲皮素、異川楝素、山柰酚、川楝素、α-蒎烯、反式茴香腦平均加樣回收率分別為96.68%、97.51%、96.19%、99.37%、101.51%、100.66%、98.26%、101.43%、103.13%，RSD 分別為1.86%、2.56%、2.14%、1.87%、1.91%、2.45%、2.00%、1.93%、2.67%。

2.9 樣品含量測定 稱取各樣品粉末3 份，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，±s，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （mg/g，±s，n＝3）

表3 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，±s，n＝3）Tab.3 Results for content determination of various constituents （mg/g，±s，n＝3）

注： —表示未檢出。與生川楝子比較，**P＜0.01； 與生小茴香比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

川楝子-小茴香蘆丁異槲皮素阿魏酸槲皮素異川楝素生品1 ∶10.060 3±0.001 60.250 3±0.143 0△△0.025 9±0.001 10.071 5±0.000 60.142 4±0.085 4**清炒1 ∶10.060 8±0.000 80.229 0±0.132 7△△0.027 5±0.001 10.073 7±0.000 90.108 7±0.061 8**鹽制1 ∶10.061 3±0.001 20.256 7±0.148 3△△0.022 6±0.001 40.077 6±0.001 80.111 4±0.064 3**生品1 ∶20.051 4±0.000 70.206 0±0.118 9△△0.020 2±0.001 60.071 8±0.000 80.107 8±0.062 0**清炒1 ∶20.059 9±0.001 40.199 1±0.115 2△△0.022 6±0.002 00.076 1±0.000 30.097 8±0.051 9**鹽制1 ∶20.050 4±0.001 40.193 2±0.111 7△△0.028 6±0.001 20.075 5±0.001 70.092 2±0.469 2**生品2 ∶10.060 3±0.001 40.216 4±0.124 9△△0.022 4±0.001 10.070 6±0.001 70.117 3±0.068 4**清炒2 ∶10.060 2±0.001 80.225 3±0.130 3△△0.022 2±0.001 20.071 7±0.000 60.097 0±0.056 5**鹽制2 ∶10.059 9±0.000 90.228 5±0.131 9△△0.022 2±0.000 70.071 7±0.002 00.115 0±0.066 4**生川楝子0.059 2±0.001 9—0.022 2±0.000 30.041 4±0.000 90.153 2±0.000 5生小茴香—0.160 4±0.001 6—0.029 1±0.000 5—川楝子-小茴香山柰酚川楝素α-蒎烯反式茴香腦生品1 ∶10.035 2±0.000 31.222 0±0.702 6**9.922 4±0.197 616.614 0±1.187 0清炒1 ∶10.036 6±0.000 31.209 2±0.698 0**7.341 1±0.112 5△14.388 0±1.185 2△鹽制1 ∶10.037 0±0.000 11.208 6±1.105 6**7.492 5±0.026 1△14.430 2±1.162 2△生品1 ∶20.034 2±0.000 11.224 2±0.532 2**9.578 9±0.014 516.426 7±0.001 9清炒1 ∶20.034 6±0.000 41.220 8±0.545 1**7.261 7±0.886 3△14.407 2±2.090 1△鹽制1 ∶20.035 0±0.000 11.157 9±0.002 8**7.779 9±0.885 4△14.933 4±1.923 4△生品2 ∶10.035 3±0.001 21.222 4±0.033 5**9.922 4±0.144 216.253 3±0.756 4清炒2 ∶10.035 9±0.000 81.152 3±0.857 2**7.341 2±0.131 3△13.991 4±2.036 3△鹽制2 ∶10.035 0±0.000 81.055 6±1.332 5**7.492 5±0.053 4△13.141 6±2.003 1△生川楝子—1.412 3±0.003 9——生小茴香0.036 2±0.000 2—10.603 5±0.052 215.676 6±0.134 9

2.10 數(shù)據(jù)分析 將表3 中的數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行處理，得到各成分總含量圖和含量變化趨勢圖，見圖2～3。

圖2 川楝子-小茴香成分總含量（±s，n＝3）Fig.2 Total contents of constiuents in Toosendan Fructus and Foeniculi Fructus （±s，n＝3）

表3 顯示，與生川楝子比較，其余樣品中蘆丁、阿魏酸、槲皮素含量升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），川楝素、異川楝素含量降低（P＜0.01）； 與生小茴香比較，其余樣品中山柰酚含量變化不明顯，異槲皮素含量升高（P＜0.01），α-蒎烯、反式茴香腦含量降低（P＜0.05）。圖2 顯示，與川楝子-小茴香（0 ∶1＋1 ∶0） 比較，生品川楝子-小茴香（1 ∶1） 總含量高于其余樣品（1 ∶2、2 ∶1） （P＜0.01），說明川楝子-小茴香1 ∶1配伍比例優(yōu)于兩者單用或1 ∶2、2 ∶1 配伍比例。清炒和鹽制后，各樣品總含量均降低，但兩者之間各成分含量及總含量均無明顯變化。圖3 顯示，炮制后蘆丁、阿魏酸、槲皮素、山柰酚含量無明顯變化，但異川楝素、川楝素、α-蒎烯、反式茴香腦含量降低，導(dǎo)致炮制品總含量低于生品。

圖3 炮制品與生品各成分含量的變化趨勢圖Fig.3 Trend of changes in the content of various constiuents of the processed and raw products

3 討論

3.1 色譜條件選擇 參考文獻(xiàn)［9-12］ 報(bào)道，流動相選擇甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸進(jìn)行考察，最終確定了色譜峰峰型美觀、分離度較好的乙腈-0.1%磷酸作為流動相。由于川楝子-小茴香藥對中9 種成分含量差異較大，因此檢測波長并不是所有化合物的最大吸收波長，如阿魏酸的最大吸收波長為322 nm，反式茴香腦的最大吸收波長為210 nm，為了兼顧含量較低化合物的出峰響應(yīng)及峰面積積分的準(zhǔn)確度，將反式茴香腦檢測波長轉(zhuǎn)換為280 nm，其余均采用210 nm。

3.2 結(jié)果分析 查閱文獻(xiàn)［13-14］發(fā)現(xiàn)，鹽川楝子-鹽小茴香常以1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1、6 ∶1 等比例配伍使用。本研究參考文獻(xiàn)［15-20］ 報(bào)道，篩選出川楝子和小茴香中9 種主要活性成分作為檢測指標(biāo)，結(jié)果顯示，川楝子、小茴香生品配伍合用較單用更有利于活性成分的溶出［21］，配伍及炮制后川楝素、異川楝素含量均降低，其原因可能是與其不穩(wěn)定的半縮醛結(jié)構(gòu)有關(guān)，加熱過程造成了物質(zhì)的分解，或是小茴香中存在“減其毒性” 的物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。α-蒎烯、反式茴香腦在炮制后含量降低，可能是由于它為揮發(fā)油類物質(zhì)，受熱易分解，炮制過程加速了這類物質(zhì)的分解。川楝子、小茴香配伍、炮制后各成分發(fā)生了復(fù)雜的變化，而蘆丁等9 種成分不能代表全部，因此，課題組后續(xù)將以篩選出的最佳配伍比例為基礎(chǔ)，結(jié)合指紋圖譜、波譜技術(shù)、藥效學(xué)試驗(yàn)作進(jìn)一步分析。