聶 超，黃華明，侯保權(quán)，周 杰，張 蕾*

（1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2.無錫市錫山人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214015； 3.南京帝瑪生物技術(shù)有限公司，江蘇 南京 210033）

骨肉瘤是起源于骨骼的惡性腫瘤，患者大多為青少年，惡性程度高，預(yù)后差［1］，這為患者及其家庭帶來極大的精神傷害，也為社會乃至國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞生長有關(guān)，目前臨床化療是治療手段之一，但由于缺乏理想效果、耐藥性頻繁出現(xiàn)、毒副作用較強(qiáng)等問題［2］，在臨床上頗受爭議。因此，從天然產(chǎn)物中提取高效、低毒的活性成分進(jìn)行替代成為當(dāng)前新的趨勢。

薯蕷皂苷元是從薯蕷科植物穿龍薯蕷根中分離出的一種植物甾體化合物，也是合成甾體激素類藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、抗免疫逃逸等作用［3-6］，但關(guān)于誘導(dǎo)骨肉瘤的自噬未見報道，而且分子作用機(jī)制不明。本實(shí)驗(yàn)旨在對薯蕷皂苷元誘導(dǎo)骨肉瘤產(chǎn)生自噬進(jìn)行探討，并闡明其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人骨肉瘤MG63、U2OS 細(xì)胞均購自美國ATCC 庫，分別用90% MEM＋10% FBS、90%DMEM＋10% FBS 完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d 更新1 次培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 薯蕷皂苷元（成都曼思特生物科技有限公司，貨號A0124，純度≥98%）。TRIzol（美國Invitrogen 公司，貨號15596-026）； cDNA 第一鏈合成試劑盒、Taq DNA Polymerase （美國Thermo Fisher Scientific 公 司，貨 號 K1622、EP0405）； LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PI3K、Akt、mTOR、pPI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin1、cleaved-caspase3 蛋白抗體、抗體稀釋液、GAPDH 內(nèi)參抗體、Braford 蛋白含量檢測試劑盒 （江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取MG63、U2OS 細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至5.0×104/mL，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h，分別加入含40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L 薯蕷皂苷元的完全培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于含37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按說明書進(jìn)行MTT 染色，于490 nm 波長處測定光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及藥物IC50。

2.2 透射電鏡檢測細(xì)胞自噬情況 取MG63、U2OS 細(xì)胞懸液，調(diào)整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養(yǎng)基 （MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L） 共同培養(yǎng)24 h，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心10 min，棄上清后PBS 洗滌2 次，加入2.5%戊二酸，4 ℃固定90 min，經(jīng)包埋、切片、檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾染色后觀察各組細(xì)胞自噬小體。

2.3 免疫熒光觀察Beclin1 蛋白表達(dá) 取MG63、U2OS 細(xì)胞懸液適量，調(diào)整密度至5.0×104/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養(yǎng)基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培養(yǎng)24 h 后自然晾干并用多聚甲醛固定液浸泡，加入H2O2-甲醇溶液、即用型山羊血清室溫孵育20 min，PBS 洗滌3 次，滴加一抗（1 ∶100）、二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，加入DAPI 染液后用防萃滅封片膠封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞高表達(dá)區(qū)域。通過Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算視野面積下的積分光密度（IOD） 值，求得平均光密度，公式為平均光密度＝IOD/視野面積。

2.4 Western blot 法檢測細(xì)胞LC3、Beclin1、cleavedcaspase3、PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達(dá) 取MG63、U2OS 細(xì)胞懸液適量，調(diào)整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養(yǎng)基（MG63，0、16 mg/L；U2OS，0、8 mg/L），培養(yǎng)24 h 后采用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行濃度測定。蛋白樣本經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，通過Bio-Rad 半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，所得PVDF 膜用5% 脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗（1 ∶200） 孵育過夜，次日室溫孵育二抗（1 ∶4 000） 1 h，ECL 試劑顯色，凝膠成像儀和Gel-Pro32 軟件采集圖像，對條帶進(jìn)行灰度分析。

2.5 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞Beclin1、caspase3 mRNA表達(dá) 取MG63、U2OS 細(xì)胞懸液適量，調(diào)整密度至5.0×105/mL，加入含薯蕷皂苷元的培養(yǎng)基（MG63，0、16 mg/L； U2OS，0、8 mg/L），培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，TRIzol 法提取總RNA，測定純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光染色法和熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時定量PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸20 s，72 ℃變性35 s，共循環(huán)45 次。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性通過熔解曲線監(jiān)測，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法分析基因相對表達(dá)量，所用引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 如圖1 所示，不同質(zhì)量濃度 （40、20、10、5、2.5、1.25 mg/L） 薯蕷皂苷元對骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞均有抑制作用，并呈劑量依賴性。薯蕷皂苷元對MG63 細(xì)胞作用24 h 的IC50值為15.7 mg/L，U2OS細(xì)胞的IC50值為8.3 mg/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取薯蕷皂苷元16 mg/L 作用于MG63 細(xì)胞，8 mg/L 作用于U2OS 細(xì)胞。

圖1 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝5）Fig.1 Effects of diosgenin on the proliferation of osteosarcoma cells （±s，n＝5）

3.2 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化的影響 如圖2 所示，對照組骨肉瘤MG3、U2OS細(xì)胞可見正常細(xì)胞核和大量線粒體； 薯蕷皂苷元處理后，MG3、U2OS 細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞破碎，線粒體消失，出現(xiàn)包裹著線粒體的自噬體。

圖2 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化的影響Fig.2 Effects of diosgenin on ultrastructural changes of osteosarcoma cells

3.3 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞Beclin1 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，對照組骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞Beclin1 蛋白熒光表達(dá)較低； 與對照組比較，薯蕷皂苷元干預(yù)后MG3、U2OS 細(xì)胞Beclin1 蛋白熒光表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞Beclin1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.3 Effects of diosgenin on expression of Beclin1 protein in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.4 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞LC3、Beclin1 蛋白表達(dá)的影響 如圖4 所示，與對照組比較，薯蕷皂苷元干預(yù)后骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞LC3 Ⅰ蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），LC3 Ⅱ、Beclin1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖4 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞LC3、Beclin1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of diosgenin on protein expressions of LC3 and Beclin1 in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.5 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖5 所示，與對照組比較，薯蕷皂苷元干預(yù)后骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達(dá)無明顯變化 （P＞0.05），p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 薯蕷皂苷元對骨肉瘤細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.5 Effects of diosgenin on expressions of PI3K/Akt/mTOR pathway-related proteins in osteosarcoma cells （±s，n＝3）

3.6 PI3K 通路抑制劑LY294002 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞Beclin1 mRNA 表達(dá)的影響 如圖6所示，與對照組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞薯蕷皂苷元組Beclin1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與薯蕷皂苷元組比較，薯蕷皂苷元＋LY294002 組Beclin1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖6 LY294002 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞Beclin1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of LY294002 on expression of Beclin1 mRNA in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

3.7 自噬抑制劑3MA 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 如圖7 所示，與3MA 組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞薯蕷皂苷元組增殖抑制率升高（P＜0.01）； 與薯蕷皂苷元組比較，MG3、U2OS細(xì)胞薯蕷皂苷元＋3MA 組增殖抑制率降低 （P＜0.01）。

圖7 3MA 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝5）Fig.7 Effects of 3MA on proliferation of osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝5）

3.8 自噬抑制劑3MA 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞caspase3 mRNA、蛋白表達(dá)的影響 如圖8～9 所示，與對照組比較，骨肉瘤MG3、U2OS 細(xì)胞薯蕷皂苷元組caspase3 mRNA 表達(dá)和cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與薯蕷皂苷元組比較，MG3、U2OS 細(xì)胞薯蕷皂苷元＋3MA 組caspase3 mRNA 表達(dá)和cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖8 3MA 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞caspase3 mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.8 Effects of 3MA on caspase3 mRNA expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

圖9 3MA 對薯蕷皂苷元干預(yù)骨肉瘤細(xì)胞caspase3 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.9 Effects of 3MA on caspase3 protein expression in osteosarcoma cells pretreated by diosgenin （±s，n＝3）

4 討論

本研究通過MTT 實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出24 h 薯蕷皂苷元對MG63 細(xì)胞IC50為15.7 mg/L，U2OS 細(xì)胞IC50為8.3 mg/L，結(jié)果顯示薯蕷皂苷元對2 種骨肉瘤細(xì)胞均有抑制作用，呈劑量依賴性。

自噬是另一種有別于凋亡的細(xì)胞死亡方式，指在真核細(xì)胞中由雙層膜包裹部分胞質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體［7］。通過透射電鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元干預(yù)后，2 種骨肉瘤細(xì)胞中的自噬體均開始增多，初步證明薯蕷皂苷元可以誘導(dǎo)2 種骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬。

Beclin1 是Atg6 的同源基因，Beclin1 表達(dá)與多種惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬呈正相關(guān)。微管相關(guān)蛋白輕鏈3 （LC3） 是自噬體中酵母Atg8 的同源基因，LC3 被刺激后可產(chǎn)生胞漿LC3I，經(jīng)過類泛素化修飾最終形成LC3Ⅱ［8］。LC3Ⅱ表達(dá)量與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)性，LC3Ⅱ增加可啟動自噬發(fā)生［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)薯蕷皂苷元干預(yù)后，2 種骨肉瘤細(xì)胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)升高，LC3I 蛋白表達(dá)降低，證明薯蕷皂苷元能夠誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬。

眾多信號通路參與自噬的調(diào)節(jié)，其中PI3K/Akt/mTOR 信號通路被認(rèn)為是負(fù)性調(diào)控自噬啟動的經(jīng)典通路［10］。PI3K 被激活后，激活下游蛋白Akt，活化的Akt 通過激活其下游蛋白雷帕霉素的蛋白激酶受體（mTOR），促進(jìn)細(xì)胞生長［11-12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薯蕷皂苷元可以抑制2 種骨肉瘤細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR 蛋白的磷酸化水平，提示薯蕷皂苷元可以通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路激活骨肉瘤細(xì)胞的自噬。PI3K/Akt/mTOR 信號通路除了與自噬的生成有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、炎癥產(chǎn)生等多方面均能發(fā)揮作用［13-15］。本實(shí)驗(yàn)通過薯蕷皂苷元和PI3K 通路抑制劑LY294002 聯(lián)合處理，發(fā)現(xiàn)在通路抑制劑的干預(yù)下，2 種骨肉瘤細(xì)胞Beclin1 mRNA 表達(dá)降低，提示PI3K/Akt/mTOR 信號通路可能是薯蕷皂苷元抑制骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬的作用靶點(diǎn)。

近年來研究表明，自噬具有抑制腫瘤的作用，也可保護(hù)腫瘤細(xì)胞生存［16-17］，當(dāng)前多種化療藥物就是通過自身產(chǎn)生的保護(hù)性自噬作用產(chǎn)生耐藥性［18］。本實(shí)驗(yàn)通過薯蕷皂苷元和自噬抑制劑3MA聯(lián)合處理，對細(xì)胞增殖抑制、凋亡蛋白caspase3 蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，以探究抑制自噬后薯蕷皂苷元對2 種骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響［19-20］。結(jié)果，在3MA的干預(yù)下2 種骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制率降低，caspase3 mRNA 表達(dá)和cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)均降低，提示薯蕷皂苷元誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生的自噬可抑制腫瘤細(xì)胞活性。

綜上所述，薯蕷皂苷元能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，可能與激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路以及上調(diào)LC3 Ⅱ和Beclin1 蛋白表達(dá)有關(guān)，同時其誘導(dǎo)的自噬可以促使骨肉瘤細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)自噬性凋亡。