尹美娟，劉真一，靳曉飛，周曉紅，高 鈺，趙月眸，高維娟

（河北中醫(yī)學(xué)院，河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

缺血性腦卒中的病理過程常發(fā)生腦缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR） 損傷［1］，其機(jī)制復(fù)雜，氧自由基的過度產(chǎn)生所引發(fā)的連鎖反應(yīng)是病情發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)［2］。線粒體是細(xì)胞的產(chǎn)能中心，I/R 產(chǎn)生的大量活性氧可使線粒體功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙，甚至死亡［3-4］。

蛋白激酶Cε（protein kinase C epsilon，PKCε）是PKC 家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶的同種型，是維持線粒體功能和神經(jīng)保護(hù)的重要信號(hào)通路［5］。煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt） 是PKCε 重要下游靶點(diǎn)，通過促進(jìn)輔酶Ⅰ （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 的合成、提高輔酶Ⅰ氧化型NAD＋和還原型NADH 比值能保持線粒體的穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)缺血性損傷后的神經(jīng)元活力。當(dāng)腦I/R 時(shí)，可激活ε減輕線粒體功能損傷［6］。此外，上調(diào)Nampt 表達(dá)可提高NAD＋/NADH 的比值，減輕線粒體損傷，同時(shí)產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用［7］。由此可知，PKCε-Nampt 是減輕腦缺血再灌注線粒體損傷的重要通路。

補(bǔ)陽還五湯是治療氣虛血瘀型腦卒中的名方，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)之效［8］。本研究建立SD 大鼠大腦中動(dòng)脈梗塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO） 模型，探索補(bǔ)陽還五湯減輕線粒體氧化損傷的作用和對(duì)PKCε-Nampt 通路的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京） 2021-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （冀） 2017-005］，飼養(yǎng)溫度、濕度適宜，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)過程都嚴(yán)格按照NIH 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》 進(jìn)行，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理原則，并經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)DWLL2019025）。

1.2 試劑與藥物 補(bǔ)陽還五湯（黃芪120 g，赤芍5 g，當(dāng)歸6 g，紅花、桃仁、川芎、地龍各3 g，水煎劑濃縮至100 mL，質(zhì)量濃度1.43 mg/L） 所用藥材均購(gòu)自北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司，其提取制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及使用劑量參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］。依達(dá)拉奉（貨號(hào)P816062，上海麥克林生化科技股份有限公司）。PKCε抗體（貨號(hào)sc-1681，美國(guó) Santa Cruz 公司）； p-PKCε 抗體 （貨號(hào)GTX52352，美國(guó)GeneTex 公司）； Nampt 抗體（貨號(hào)EPR21980，英國(guó)Abcam 公司）； MAP-2、βactin 抗體、二抗 （貨號(hào)GB11128-2、GB15001、GB23301，武漢賽維爾生物科技有限公司）；NAD＋/NADH 檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位（JC-1）試劑盒（貨號(hào)S0175、C2003S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）； 0.45 μm 聚偏二氟乙烯（ polyvinylidene fluoride，PVDF ） 膜 （ 貨 號(hào)IPVH00010，美國(guó) Millipore 公司）； 活性氧（ reactive oxygen species，ROS ）、丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 試劑盒（貨號(hào)E004-1-1、A003-1-2、A001-3-2，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 儀器 Fusion FX5 Spectra 多功能成像系統(tǒng)（法國(guó)Vilber 公司）； 顯微鏡拍照系統(tǒng)、DM5000B正置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 大鼠局灶性腦I/R 損傷模型制備 采用栓線法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg） 進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，消毒，備皮，在頸部正中開口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA） 及頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA），結(jié)扎ECA，用動(dòng)脈夾夾閉CCA 與ICA，迅速于ECA 與ICA 分叉處作一切口，插入線栓沿頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦前動(dòng)脈起始端，入栓深度20 mm 左右遇阻力停止，2 h 后輕輕拔出線栓，縫合傷口。

2.2 分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組，假手術(shù)組僅分離血管，不插線栓，其余各組按“2.1” 項(xiàng)下方法進(jìn)行造模。術(shù)后24 h，補(bǔ)陽還五湯組灌胃補(bǔ)陽還五湯14.3 g/kg［10-11］，依達(dá)拉奉組腹腔注射依達(dá)拉奉3 mg/kg，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積蒸餾水，每隔24 h 給藥1 次，連續(xù)7 d，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后處死取材。

2.3 Zea-longa 評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺陷 按照隨機(jī)雙盲法原則，參照Zea-longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)［12-13］，0 分，無神經(jīng)損傷癥狀； 1 分，懸尾實(shí)驗(yàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪； 2 分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈； 3 分，向?qū)?cè)傾倒； 4 分，無自主活動(dòng)或陷入深度昏迷中，1～3 分為造模成功。除假手術(shù)組外，其余各組0、4 分大鼠予以剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充造模成功者以保證每組數(shù)量一致。

2.4 TTC 染色檢測(cè)腦梗死體積百分比 大鼠麻醉后快速取出完整腦組織，冰凍20 min 后切成2 mm冠狀切片，浸泡在TTC 染液中，放置在37 ℃恒溫箱中避光孵育20 min，每10 min 翻動(dòng)1 次。完成染色后，4%多聚甲醛固定過夜后拍照。采用Image J 圖像分析軟件計(jì)算大鼠腦梗死體積占總體積的百分比。

2.5 免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2（MAP-2） 表達(dá) 大鼠麻醉灌流后取出完整腦組織，經(jīng)固定、石蠟包埋后切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗，封閉液室溫封閉1 h，滴加一抗MAP-2 （1 ∶200） 4 ℃孵育過夜，洗滌后用Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 熒光抗體（1 ∶500） 室溫孵育1 h，洗滌后用含DAPI 的抗熒光淬滅劑封片。通過熒光顯微鏡分別采集大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域DAPI、MAP-2 圖像，將2 種熒光圖像融合，分析MAP-2 熒光強(qiáng)度，采用Image J 軟件分析并計(jì)算平均光密度以評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷情況。

2.6 腦組織氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 大鼠麻醉后快速剝離出大腦皮層組織，置于PBS 緩沖液中勻漿，12 000×g離心20 min，按照各試劑盒說明書檢測(cè)組織上清液中ROS、MDA 水平和SOD 活性。

2.7 腦組織線粒體膜電位檢測(cè) 大鼠麻醉后快速剝離大腦皮層組織，采用線粒體分離試劑分離線粒體，加入JC-1 染色液進(jìn)行染色，在激發(fā)波長(zhǎng)490 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm 下檢測(cè)JC-1 單體，在激發(fā)波長(zhǎng)525 nm、發(fā)射波長(zhǎng)590 nm 下檢測(cè)JC-1 聚集體，通過JC-1 聚集體與單體的相對(duì)比值表示線粒體膜電位。

2.8 修飾酶循環(huán)法檢測(cè)腦組織NAD＋/NADH比值 大鼠麻醉后快速剝離出大腦皮層半暗帶組織，根據(jù)試劑盒說明書分別提取NAD＋和NADH，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度，計(jì)算兩者比值。

2.9 Western blot 檢測(cè)PKCε-Nampt 信號(hào)通路蛋白表達(dá) 大鼠麻醉后快速剝離出大腦皮層半暗帶組織，加入裂解液研磨破碎，沉降、振蕩、離心后采用BCA 法測(cè)定蛋白含量。蛋白經(jīng)99 ℃加熱變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，一抗PKCε（1 ∶500）、p-PKCε（1 ∶1 000） 和Nampt （1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育1 h，顯影，成像，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J 軟件進(jìn)行分析。

2.10 免疫組化檢測(cè)p-PKCε和Nampt 蛋白表達(dá)大鼠麻醉灌流后取出完整腦組織，經(jīng)固定、包埋后切片，浸泡在檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中，微波爐加熱20 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻后用PBS 洗滌，加雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶，3% BSA 室溫封閉1 h，一抗p-PKCε（1 ∶200） 和Nampt （1 ∶200） 4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌后用辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔IgG （1 ∶500） 室溫孵育1 h，PBS 洗滌后滴加DAB 顯色液，于顯微鏡下觀察到棕黃色陽性表達(dá)時(shí)ddH2O 洗滌，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域并采集圖片，采用Image J 軟件分析并計(jì)算平均光密度以評(píng)價(jià)蛋白表達(dá)。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0、GraphPad Prism 5.01 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 如圖1 所示，假手術(shù)組無神經(jīng)功能損傷，評(píng)分為0； 與假手術(shù)組比較，模型組Zea-longa 評(píng)分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組Zea-longa 評(píng)分降低（P＜0.05），并且前者低于后者（P＜0.05）。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響（±s，n＝6）Fig.1 Effects of Buyang Huanwu Decoction on neurological function score of MCAO rat models （±s，n＝6）

3.2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦梗死體積的影響 如圖2 所示，紅色為無損傷腦組織，白色為腦梗死組織； 假手術(shù)組未見白色梗死區(qū)； 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織可見明顯白色梗死區(qū)，腦梗死體積百分比升高（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組腦組織梗死體積百分比降低（P＜0.05），并且前者低于后者（P＜0.05）。

圖2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦梗死體積的影響（±s，n＝3）Fig.2 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral infarction volume in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織MAP-2 表達(dá)的影響 MAP-2 是組成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要組成成分，存在于神經(jīng)元的胞體、樹突中，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志物［14］，通過免疫熒光觀察MAP-2 在I/R 前后的表達(dá)變化情況，以此判定神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度。如圖3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組MAP-2 熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組MAP-2 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05），并且前者高于后者（P＜0.05）。

圖3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織MAP-2 表達(dá)的影響（×400，±s，n＝3）Fig.3 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral MAP-2 expression of MCAO rat models （×400，±s，n＝3）

3.4 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織線粒體膜電位的影響 如圖4 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)線粒體膜電位降低（P＜0.05），提示線粒體去極化； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組可逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象，其線粒體膜電位升高（P＜0.05），2 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織線粒體膜電位的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral mitochondrial membrane potential of MCAO rat models （±s，n＝3）

3.5 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響 如圖5 所示，與假手術(shù)組比較，模型組ROS、MDA 水平升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組ROS、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05），2 組氧化應(yīng)激水平比較無明顯差異（P＞0.05）。

圖5 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平的影響（±s，n＝3）Fig.5 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral oxidative stress of MCAO rat models （±s，n＝3）

3.6 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠PKCε、p-PKCε、Nampt 蛋白表達(dá)的影響 如圖6 所示，與假手術(shù)組比較，模型組PKCε、Nampt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p-PKCε蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組PKCε、p-PKCε、Nampt 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），并且前者p-PKCε、Nampt 蛋白表達(dá)高于后者（P＜0.05），2 組PKCε蛋白表達(dá)比較無明顯差異（P＞0.05）。

圖6 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠PKC ε、p-PKC ε和Nampt 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.6 Effects of Buyang Huanwu Decoction on protein expressions of PKCε，p-PKCεand Nampt in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.7 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠p-PKCε、Nampt 蛋白陽性表達(dá)的影響 如圖7 ～8 所示，與假手術(shù)組比較，模型組p-PKCε 陽性表達(dá)升高（P＜0.05），Nampt 陽性表達(dá)降低（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組p-PKCε、Nampt 陽性表達(dá)升高 （P＜0.05），補(bǔ)陽還五湯組p-PKCε、Nampt 蛋白陽性表達(dá)高于依達(dá)拉奉組（P＜0.05）。

圖7 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠p-PKC ε表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.7 Effects of Buyang Huanwu Decoction on expression of p-PKC εin MCAO rat models （±s，n＝3）

圖8 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠Nampt 表達(dá)的影響（±s，n＝3）Fig.8 Effects of Buyang Huanwu Decoction on expression of Nampt in MCAO rat models （±s，n＝3）

3.8 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織NAD＋/NADH 比值的影響 如圖9 所示，與假手術(shù)組比較，模型組NAD＋/NADH 比值降低（P＜0.05）； 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組和依達(dá)拉奉組NAD＋/NADH 比值升高（P＜0.05），2 組比較無明顯差異（P＞0.05）。

圖9 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO 大鼠腦組織NAD＋/NADH 比值的影響（±s，n＝3）Fig.9 Effects of Buyang Huanwu Decoction on cerebral NAD＋/NADH ratio of MCAO rat models （±s，n＝3）

4 討論

腦I/R 損傷是急性缺血性腦卒中血流再通后發(fā)生的繼發(fā)性損傷，再引發(fā)多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而ROS大量產(chǎn)生是其主要病理環(huán)節(jié)。線粒體是ROS 主要產(chǎn)生場(chǎng)所，ROS 的大量生成可損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體功能異常，而線粒體功能異常又會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)ROS 生成，加重氧化應(yīng)激，可見氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致I/R 后線粒體損傷的關(guān)鍵［15］。另外，ROS能破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)，造成線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。脂質(zhì)是生物膜的重要組成［16］，脂質(zhì)損傷生成的MDA 可以在一定程度上體現(xiàn)ROS 對(duì)線粒體膜損傷的程度。SOD 是體內(nèi)重要的抗氧化酶，線粒體所產(chǎn)生的ROS 主要由位于線粒體內(nèi)的Mn-SOD 清除，SOD 活性可以體現(xiàn)線粒體的抗氧化能力。過度氧化應(yīng)激損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，造成腦I/R 損傷。

PKCε是影響神經(jīng)細(xì)胞生存和功能恢復(fù)，調(diào)節(jié)線粒體功能的重要靶點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞能量充足時(shí)，PKCε處于失活狀態(tài)，當(dāng)腦I/R 損傷時(shí)，PKCε從胞漿向質(zhì)膜移位，激活了PKCε的Ser-729 磷酸化位點(diǎn)，從而細(xì)胞中p-PKCε 增多［17］。NAD 是細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子，主要有2 種形式，即NAD＋和NADH。在氧化還原反應(yīng)中NAD＋/NADH 比例的相對(duì)穩(wěn)定可維持線粒體功能。Nampt 是生產(chǎn)NAD 的酶，對(duì)線粒體和神經(jīng)功能起保護(hù)作用［18］。Nampt表達(dá)的增加會(huì)提高NAD＋水平和NAD＋/NADH 比例［19］。PKCε是Nampt 上游的重要蛋白，缺血時(shí)NAD＋消耗過多，PKCε 可介導(dǎo)線粒體NAD＋生成，維持線粒體DNA 完整性，減輕缺血性損傷［20］。由此可知，PKCε-Nampt 可通過提高線粒體NAD＋/NADH 比例來保護(hù)神經(jīng)功能。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性腦卒中基本病機(jī)是氣虛血瘀、腦脈阻滯［21］。益氣活血能改善氣血運(yùn)行，使上達(dá)腦竅氣血充足，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［22］。補(bǔ)陽還五湯能益氣活血，是治療氣虛血瘀型腦卒中的經(jīng)典方劑，全方重用黃芪補(bǔ)氣，配伍活血化瘀藥，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之效［23］。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化反應(yīng)和為細(xì)胞提供能量的主要場(chǎng)所，而中醫(yī)中“元?dú)狻?具有調(diào)控全身氣血的功能，兩者均具有推動(dòng)、激發(fā)生理活動(dòng)的功能，恢復(fù)線粒體功能正體現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯的補(bǔ)氣活血功效。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，是臨床上治療缺血性腦卒中的常用藥，而氧自由基與線粒體損傷息息相關(guān)，故選擇依達(dá)拉奉為陽性對(duì)照藥［24］。本研究通過建立大鼠MCAO模型，以腦缺血2 h 再灌注7 d 模擬缺血性腦卒中損傷［25］，給予補(bǔ)陽還五湯干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該方可改善神經(jīng)功能缺陷，減少腦梗死體積，提高M(jìn)AP-2 表達(dá)，降低ROS 及MDA 水平，提高SOD 活性，減輕氧化應(yīng)激損傷，恢復(fù)線粒體膜電位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯可提高PKCε、p-PKCε和Nampt蛋白表達(dá)，提高腦組織NAD＋/NADH 比值。以上結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯可以恢復(fù)線粒體功能降低氧化應(yīng)激，減輕腦缺血再灌注損傷，其作用可能與激活PKCε-Nampt 通路有關(guān)。