王青玲，張夢(mèng)嫻，周潁東，康浩然，郭向東*，王慶林

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 3.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 451191）

老年性聾是老年人最常見(jiàn)的一種感覺(jué)障礙，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今為止尚無(wú)有效措施減輕耳蝸細(xì)胞的損傷，改善聽(tīng)覺(jué)功能的預(yù)后［1-2］。老年性聾的病理改變主要是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞 （inner hair cell，IHC）、外毛細(xì)胞（outer hair cell，OHC）、血管紋 （stria vascularis，SV）、螺旋韌帶 （spiral ligament，SL）、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 （spiral ganglion cells，SGC） 等變性［3］，但其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。既往研究表明，自噬對(duì)耳蝸的發(fā)育和功能成熟起重要作用，上調(diào)可減輕耳蝸細(xì)胞損傷，防止聽(tīng)力下降，而下調(diào)可能是導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞衰老失活的重要原因之一［4］。

銀杏葉提取物已被廣泛應(yīng)用于臨床，多項(xiàng)專家共識(shí)指出它對(duì)突發(fā)性聾、耳源性眩暈、神經(jīng)血管性疾病等具有較好的臨床療效，對(duì)于延緩老年性聾也有一定的作用［5-6］，實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其可通過(guò)調(diào)節(jié)耳蝸細(xì)胞自噬與凋亡來(lái)減輕噪聲性耳聾。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立老年性聾大鼠模型，觀察銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸組織形態(tài)學(xué)和聽(tīng)功能的影響，以及對(duì)耳蝸組織中自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，深入探究其延緩耳蝸細(xì)胞衰老的機(jī)制，以期為臨床治療老年性聾提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 聽(tīng)閾正常的雄性SPF 級(jí)SD 大鼠45 只，8 周齡，體質(zhì)量（220±10） g，由鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫） 2019-0002，合格證號(hào)4109812011000 11477］，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK （豫） 2017-0001］，SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，室內(nèi)溫度（24±3）℃，自由飲食和攝水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。研究方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn) （倫理號(hào)DWLL202203009），實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遵循3R 原則給予人道關(guān)懷和保護(hù)。

1.2 試劑與藥物 BCA 試劑盒、2.5% 戊二醛、DAPI 溶液 （北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)PC0021、P1126、C0060）； 10%水合氯醛（廣州艾肯曼生物科技有限公司，批號(hào)DM0001）； Beclin1、LC3、P62 抗體 （ 美國(guó) GeneTex 公司，批號(hào)GTX55535、GTX127375、GTX128171）； Myosin-Ⅶa 抗體（美國(guó)Protrus BioSciences 公司，批號(hào)25-6790）； Alexa Flour 488 抗體（美國(guó)Jackson 公司，批號(hào)111-545-003）； 內(nèi)參抗體GAPDH、SDS-PAGE快速凝膠試劑盒［攸碧艾（上海） 貿(mào)易有限公司，批號(hào)UBI6010、UBI3002］。銀杏葉提取物（金納多，臺(tái)灣濟(jì)生醫(yī)藥生技股份有限公司，批號(hào)HC20090014）。

1.3 儀器 聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀（美國(guó)智聽(tīng)公司）；JY-BMB 型石蠟包埋機(jī)、JY-QPC 冷凍切片機(jī)（湖北錦源醫(yī)療科技有限公司）； RM2135 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）； KD-P 型攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）； PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）； DGG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）； 3K15 型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）； VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀、EPS300 型電泳儀、VE-180 型電泳槽、VE-186 型轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）； JEM-1400 型透射電子顯微鏡（日本JEOL 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 45 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和銀杏葉提取物低、中、高劑量組（10、20、30 mg/kg），每組9 只，對(duì)照組大鼠每天皮下注射500 mg/kg 生理鹽水，模型組和銀杏葉提取物各劑量組大鼠每天皮下注射500 mg/kgD-gal，連續(xù)8 周。8 周后，銀杏葉提取物低、中、高劑量組大鼠腹腔注射10、20、30 mg/kg 銀杏葉提取物，對(duì)照組和模型組大鼠腹腔注射等體積0.9%生理鹽水，每天1 次，連續(xù)8 周。

2.2 聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位（ABR） 閾值檢測(cè) 大鼠麻醉后連接電極，以Tone 為刺激音，從80 dBSPL開(kāi)始以10 dBSPL 遞減，接近閾值時(shí)以5 dBSPL 遞減，分別記錄4、8、16、24、32 kHz 頻率對(duì)短純音刺激的反應(yīng)，直至能分辨出Ⅲ波的最低刺激強(qiáng)度確定反應(yīng)閾值。

2.3 HE 染色觀察耳蝸組織病理學(xué) 耳蝸組織經(jīng)固定、脫鈣、梯度脫水、包埋、連續(xù)切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下用Image View 進(jìn)行拍照，并對(duì)底回耳蝸毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等形態(tài)和數(shù)量變化進(jìn)行記錄。

2.4 免疫熒光染色觀察耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞數(shù) 分離耳蝸基底膜，鋪片，10%山羊血清封閉通透，4 ℃冰箱放置過(guò)夜，一抗（rabbit anti-Myosin-Ⅶa） 孵育過(guò)夜，二抗（Alexa Flour 488 donkey anti-rabbit）避光孵育2 h，DAPI 室溫孵育15 min，抗猝滅甘油（Fluoromount-GTM） 封片，采用Image View 進(jìn)行拍照，在熒光顯微鏡下分別對(duì)各組大鼠耳蝸底回100 μm 內(nèi)外毛細(xì)胞存活數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.5 透射電子顯微鏡觀察耳蝸毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)耳蝸置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定24 h，脫鈣1 周，取下基底膜，1%鋨酸4 ℃固定2 h，梯度乙醇浸沒(méi)，丙酮脫水，將組織包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中，進(jìn)行超薄切片，切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色20 min，水洗，烘干，使用透射電子顯微鏡拍照。

2.6 Western blot 法檢測(cè)耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達(dá) 液氮冷凍耳蝸組織，取下其蝸軸與基底膜，稱取20 μg 組織用勻漿機(jī)破碎，加入250 μL 裂解液，冰上裂解10 min，離心30 min，取上清，按照BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量后加熱變性。制備凝膠，蛋白樣本經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入Beclin1 （1 ∶1 500）、LC3 （1 ∶1 500）、P62 （1 ∶1 500） 和GAPDH （1 ∶1 000） 一抗工作液，在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶1 000），在搖床上孵育2 h，洗膜后滴加ECL 超敏發(fā)光液，通過(guò)Image Lab 成像系統(tǒng)顯影，采用Image J 軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行測(cè)量，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 25.0、GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)； 方差不齊時(shí)，采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠ABR 閾值的影響 治療前，與對(duì)照組比較，其余4 組ABR 閾值在4、8、16、24、32 kHz 時(shí)均提高（P＜0.01），并且組間無(wú)差異（P＞0.05），見(jiàn)圖1A。治療后，與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組ABR 閾值在4、8、16、24、32 kHz 時(shí)均降低（P＜0.05，P＜0.01），其中高劑量組低頻4、8 kHz 時(shí)對(duì)聽(tīng)力的改善程度最佳，見(jiàn)圖1B。

圖1 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠ABR 閾值的影響（±s，n＝9）Fig.1 Effects of G.biloba extract on ABR threshold of presbycusis in rats （±s，n＝9）

3.2 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸病理形態(tài)的影響 對(duì)照組毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等形態(tài)均正常，輪廓清晰，胞漿飽滿，胞核排列整齊、均勻一致； 與對(duì)照組比較，模型組毛細(xì)胞及纖維斷裂、折疊、丟失，血管紋厚度萎縮 （P＜0.01），螺旋韌帶密度降低，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)大量丟失（P＜0.01），螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)大量空泡樣變，細(xì)胞核變形、溶解、甚至消失； 與模型組比較，銀杏葉提取物低劑量組耳蝸細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，中、高劑量組毛細(xì)胞形態(tài)改善，血管紋厚度增加（P＜0.01），螺旋韌帶形態(tài)逐漸趨于正常，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01），并且胞漿飽滿，細(xì)胞核逐漸變大，空泡樣變性逐漸減輕，見(jiàn)圖2、表1。

表1 各組大鼠耳蝸血管紋厚度和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

表1 各組大鼠耳蝸血管紋厚度和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較（±s，n＝9）Tab.1 Comparison of thicknesses of cochlear stria and number of spiral ganglion cells in rats of each group （±s，n＝9）

注： 與對(duì)照組比較，△△P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別血管紋厚度/μm 螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量/個(gè)對(duì)照組52.56±5.8746.15±2.25模型組20.85±4.79△△21.86±1.96△△銀杏葉提取物低劑量組21.17±3.2622.65±2.92銀杏葉提取物中劑量組40.75±6.83＃＃31.53±1.68＃＃銀杏葉提取物高劑量組42.85±4.62＃＃37.27±0.53＃＃

圖2 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸病理形態(tài)的影響（×200）Fig.2 Effects of G.biloba extract on pathological morphology of cochlea in presbycusis rat models （×200）

3.3 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)及存活數(shù)的影響 本實(shí)驗(yàn)中Myosin-Ⅶa 抗體在毛細(xì)胞胞漿中表達(dá)呈綠色熒光，DAPI 為細(xì)胞核染色呈藍(lán)色熒光，Merge 為毛細(xì)胞胞漿、胞核組合呈藍(lán)綠色熒光。圖3 顯示，對(duì)照組一排內(nèi)毛細(xì)胞和三排外毛細(xì)胞的胞核及胞漿排列整齊，輪廓清晰，結(jié)構(gòu)規(guī)整； 模型組大量外毛細(xì)胞和部分內(nèi)毛細(xì)胞丟失、壞死，毛細(xì)胞存活數(shù)降低（P＜0.01），殘存的內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)變性、結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞間出現(xiàn)融合； 與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組內(nèi)、外毛細(xì)胞形態(tài)均有所改善，存活數(shù)均提高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸毛細(xì)胞形態(tài)和存活數(shù)的影響（×200，±s，n＝9）Fig.3 Effects of G.biloba extract on morphology and survival number of cochlear hair cells in presbycusis rat models （×200，±s，n＝9）

3.4 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對(duì)照組大鼠耳蝸毛細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)正常，自噬小體數(shù)量較多，胞漿內(nèi)線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)均完整，密度均一； 與對(duì)照組比較，模型組毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，自噬小體數(shù)量減少（P＜0.01），胞漿內(nèi)線粒體密度降低，出現(xiàn)空泡樣變，并且高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器溶解、消失； 與模型組比較，銀杏葉提取物低劑量組變化不明顯，中、高劑量組毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)逐漸改善，自噬小體數(shù)量逐漸增多（P＜0.05，P＜0.01），胞漿內(nèi)線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)改善，見(jiàn)圖4。

圖4 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸毛細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響（±s，n＝9）Fig.4 Effects of G.biloba extract on ultrastructure of cochlear hair cells in presbycusis rat models （±s，n＝9）

3.5 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均降低（P＜0.01），P62 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與模型組比較，銀杏葉提取物各劑量組大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高（P＜0.05，P＜0.01），P62蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 銀杏葉提取物對(duì)老年性聾大鼠耳蝸組織Beclin1、LC3、P62 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝9）Fig.5 Effects of G.biloba extract on protein expressions of Beclin1，LC3 and P62 in cochlea of presbycusis rat models（±s，n＝9）

4 討論

老年性聾是由耳蝸和聽(tīng)覺(jué)中樞的年齡相關(guān)性退化引起的，其病理因素與耳蝸細(xì)胞的變性密切相關(guān)［7］。隨著機(jī)體老化，毛細(xì)胞及血管紋變性，可能引起螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致聽(tīng)力減退［8］。到目前為止，老年性聾的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，耳蝸細(xì)胞自噬功能異?？赡苁抢夏晷悦@主要發(fā)病機(jī)制之一［9-11］。衰老耳蝸中，自噬功能障礙，導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞受損，聽(tīng)功能減退［12］。因此，尋求有效提高自噬功能的藥物，可能對(duì)減輕耳蝸細(xì)胞變性，延緩聽(tīng)力損失有重要意義。

銀杏葉提取物對(duì)多種內(nèi)耳疾病有較好的臨床療效［13-14］。袁海虹等［15］發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過(guò)提高自噬功能，上調(diào)視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后細(xì)胞存活率。近期，郭濤等［16］發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可上調(diào)自噬功能來(lái)緩解腦卒中。鑒于此，本課題組推測(cè)銀杏葉提取物可能是通過(guò)調(diào)控自噬水平來(lái)延緩聽(tīng)覺(jué)細(xì)胞衰老的。本研究采用ABR 來(lái)檢測(cè)老年性聾聽(tīng)閾的變化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠不同頻率ABR 閾值均提高； 經(jīng)不同劑量銀杏葉提取物給藥后，ABR 閾值均降低，表明銀杏葉提取物可改善老年性聾大鼠的聽(tīng)閾。本研究病理結(jié)果與既往研究相吻合［17］。對(duì)照組大鼠毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等形態(tài)正常； 與對(duì)照組比較，模型組大鼠毛細(xì)胞、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等損傷；經(jīng)銀杏葉提取物干預(yù)后，以上細(xì)胞的形態(tài)改善。免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組內(nèi)、外毛細(xì)胞存活數(shù)降低； 經(jīng)不同劑量銀杏葉提取物干預(yù)后，內(nèi)、外毛細(xì)胞存活數(shù)均提高。

Beclin1、LC3、P62 均是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵標(biāo)志物，常用于評(píng)估自噬的活性程度［18］。Yuan等［19］研究表明，與青年大鼠比較，老年大鼠聽(tīng)皮層的自噬流受阻，LC3 和Beclin1 蛋白表達(dá)降低，導(dǎo)致老化大鼠聽(tīng)力損失。He 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，新霉素導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞中Beclin1 和LC3 表達(dá)降低，P62 大量聚集，誘導(dǎo)毛細(xì)胞損傷。為了進(jìn)一步探討銀杏葉提取物是否通過(guò)調(diào)控耳蝸細(xì)胞自噬對(duì)老年性聾發(fā)揮保護(hù)作用，本研究觀察了耳蝸毛細(xì)胞自噬小體并檢測(cè)了Beclin1、LC3、P62 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠耳蝸毛細(xì)胞中自噬小體數(shù)量減少，耳蝸組織中Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低，P62 蛋白表達(dá)升高； 而經(jīng)不同劑量銀杏葉提取物干預(yù)后，自噬小體數(shù)量逐漸增加，Beclin1、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，P62 蛋白表達(dá)降低。

綜上所述，自噬是探索老年性聾發(fā)病機(jī)制的新視角，老年性聾大鼠耳蝸組織的自噬水平降低，而銀杏葉提取物可修復(fù)受損的耳蝸細(xì)胞形態(tài)，延緩聽(tīng)覺(jué)細(xì)胞的衰老，改善老年性聾大鼠的聽(tīng)功能，其機(jī)制可能與調(diào)控耳蝸組織中Beclin1、LC3Ⅱ和p62 蛋白表達(dá)，上調(diào)自噬有關(guān)。