王 偉，趙鴻雙，吳天元，李 錚，陸勃帆，李 慧，吳 巍

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117）

人參皂苷Re 是原人參三醇型單體皂苷之一［1］，在抗心律失常、抗休克、抗血小板凝集方面具有很好的藥理活性［2-3］，但該成分水溶性較差，導(dǎo)致其生物利用度低，從而限制臨床發(fā)展及新藥開發(fā)［4］。包合技術(shù)是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的方法，在藥學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［5-7］，藥物被環(huán)糊精包合后溶解性和生物利用度均能明顯改善，廣泛應(yīng)用于口服、注射原料藥［8-10］。

課題組前期曾選擇貝塔環(huán)糊精作為載體，制備人參皂苷Re 超分子包合物，發(fā)現(xiàn)原料藥生物利用度顯著提高。本實驗研究阿爾法環(huán)糊精、貝塔環(huán)糊精、伽馬環(huán)糊精、羥丙基貝塔環(huán)糊精、羥丙基伽馬環(huán)糊精對人參皂苷Re 的包合作用，探討其包合機制［11-12］，并結(jié)合相溶解度法進行驗證［13-15］，以期為人參皂苷Re 臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)，并為相關(guān)超分子藥物定量構(gòu)效關(guān)系的探討提供參考依據(jù)［16-17］。

1 材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀 （美國Agilent公司）； SHZ-82 恒溫水浴振蕩鍋（金壇市盛威實驗儀器廠）。人參皂苷Re 對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%）。阿爾法環(huán)糊精（相對分子質(zhì)量972.84）、貝塔環(huán)糊精（相對分子質(zhì)量1 134.98）、伽馬環(huán)糊精 （相對分子質(zhì)量1 297.12）、羥丙基貝塔環(huán)糊精 （相對分子質(zhì)量1 541.54）、羥丙基伽馬環(huán)糊精 （相對分子質(zhì)量1 741） 均購自上海麥克林生化科技有限公司。乙腈、甲醇均為色譜純（美國Fisher 公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法

2.1 分子構(gòu)建及結(jié)構(gòu)優(yōu)化 各環(huán)糊精結(jié)構(gòu)分別獲得于劍橋晶體數(shù)據(jù)庫［www.ccdc.cam.ac.uk/structures/，阿爾法環(huán)糊精（1100537）、貝塔環(huán)糊精（181781） 和伽馬環(huán)糊精 （1978774）］ 和ChemSpider 數(shù)據(jù)庫 ［www.chemspider.com，羥丙基貝塔環(huán)糊精（128446-35-5） 和羥丙基伽馬環(huán)糊精（128449-34-4）］。采用Chemdraw 20.0 軟件繪制人參皂苷Re 結(jié)構(gòu)，將其保存為“.mol” 格式，Chemdraw 3D 保存最優(yōu)構(gòu)象。

2.2 量化計算法（Gaussian） 研究主客體形成的熱力學(xué)參數(shù) PM3 方法考慮了非鍵合原子之間的相互作用力，在研究超分子（比如環(huán)糊精分子）時可得到比較穩(wěn)定的計算結(jié)果，并且B3LYP/6-31G （d） 方法在藥物小分子的計算方面有較高的精確度。因此，本研究采用Gaussian06 軟件包中的ONIOM （B3LYP /6-31G*： PM3） 分層算法對取代環(huán)糊精體系的包合反應(yīng)進行模擬，即主體分子的5種環(huán)糊精采用PM3 算法，包合過程則采用B3LYP/6-31G*算法。

2.3 分子動力學(xué)模擬（MD） 主客體包合過程MD 以能量最小化處理后的結(jié)構(gòu)為初始結(jié)構(gòu)，利用Materials Studio 2020 （美國Accelrys 公司） 模塊Amorphous Cell 中的Construction 建立人參皂苷Re、環(huán)糊精分子晶胞，cell 為周期性邊界條件，盒子尺寸19.5 cm×19.5 cm×19.5 cm，設(shè)置比例為1 ∶1，密度為1 g/cm3，為了區(qū)別主體分子環(huán)糊精和客體分子人參皂苷Re，前者以線狀模型表示，后者以球狀模型表示。建立晶胞后，采用Forcite 對其進行能量最小化處理，再以其包含的Dynamics 模塊進行恒溫恒容（NVT） 模擬，當(dāng)體系能量穩(wěn)定后進行恒溫恒壓（NPT） 模擬，條件為Compass 力場，溫度298、310 K，時間步長1 fs，其中NVT為50 ps，NPT 為1 000 ps，壓力為1.0×10-4GP。

2.4 人參皂苷Re 相溶解度測定 精密稱取各環(huán)糊精適量，分別制成濃度為5 ～100 mmol/L 的阿爾法環(huán)糊精、伽馬環(huán)糊精、羥丙基貝塔環(huán)糊精、羥丙基伽馬環(huán)糊精溶液，以及濃度為1～10 mmol/L 的貝塔環(huán)糊精溶液，加入過量人參皂苷Re，分別在25、37° C 下水浴振蕩72 h，吸取0.8 mL，過濾，加500 μL 甲醇，混勻后再過濾，采用HPLC 法測定人參皂苷Re 含量。分析條件為Ascentis ? Express C18色譜柱（5 cm×3.0 mm，2.7 μm）； 流動相乙腈-水 （15 ∶ 85）； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長203 nm； 進樣量5 μL。

3 結(jié)果

3.1 主客體分子包合過程模擬 首先，采用B3LYP/6-31G （d） 算法對5 種主體分子結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化，使其無虛頻，獲得主體分析最優(yōu)構(gòu)象。再采用PM3 算法計算環(huán)糊精、人參皂苷Re 結(jié)合能，獲得兩者結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 人參皂苷Re 與包合物的熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Thermodynamic parameters for ginsenoside Re and inclusion compounds

由此可知，各環(huán)糊精形成包合物后偶極矩均發(fā)生變化，具有不同于主-客體的新型結(jié)構(gòu)形式，越穩(wěn)定的包合物具有越大的負結(jié)合能（△E），而包合物的焓變值（△H） 均為負值，表明主客體形成包合物的過程均為吸熱過程； 熵值（△S） 為正值，表明在包合過程中體系的混亂程度增加； 各包合物吉布斯自由能（△G） 也均為負值，表明人參皂苷Re 與環(huán)糊精的包合過程均為自發(fā)反應(yīng)，即包合物形成的驅(qū)動力來源于焓熵協(xié)同驅(qū)動力。另外，人參皂苷Re 與伽馬環(huán)糊精結(jié)合的△G、△H絕對值最大，表明反應(yīng)最容易，即人參皂苷Re 與5 種主體分子反應(yīng)的難易程度依次為IC人參皂苷Re/伽馬環(huán)糊精＞IC人參皂苷Re/貝塔環(huán)糊精＞IC人參皂苷Re/羥丙基伽馬環(huán)糊精＞IC人參皂苷Re/羥丙基貝塔環(huán)糊精＞IC人參皂苷Re/阿爾法環(huán)糊精。

人參皂苷Re 與5 種環(huán)糊精結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象見圖1。由此可知，人參皂苷Re 與阿爾法環(huán)糊精結(jié)合的最穩(wěn)定構(gòu)象是將前者懸于后者大口端上方，只有部分存在于前者C6 位葡萄糖殘基上的羥基能插入后者孔徑中（圖1A）； 人參皂苷Re 與受體分子貝塔環(huán)糊精結(jié)合時，前者貫穿于后者中，并且也是前者C6 位的葡萄糖殘基插入后者空腔中 （圖1B）； 伽馬環(huán)糊精孔徑比貝塔環(huán)糊精更大（0.75 ～0.83 nm），使得人參皂苷Re 可貫穿于空腔內(nèi)，導(dǎo)致進一步緊密的結(jié)合（圖1C）； 羥丙基貝塔環(huán)糊精、羥丙基伽馬環(huán)糊精由于羥基被取代成羥丙基，客體分子進入空間內(nèi)的位阻增加，導(dǎo)致人參皂苷Re 與其結(jié)合不緊密，僅是浮于環(huán)糊精上方，而且兩者中的羥丙基衍生基團雖然提高了溶解度，但也增加了配體分子的空間位阻，使其入環(huán)的阻力增加（圖1D、1E）。綜上所述，在與不同環(huán)糊精分子的結(jié)合過程中，人參皂苷Re 均從其大口端向小口端進入，其中貝塔環(huán)糊精和伽馬環(huán)糊精能將該成分包裹于空腔中，而其他3 種環(huán)糊精只能與其形成部分包合物； 伽馬環(huán)糊精能將該成分包裹于空腔中，表明疏水作用力也是兩者包合的主要作用力，可能也是其相溶解度較大的主要原因。

圖1 人參皂苷Re 與環(huán)糊精結(jié)合的最穩(wěn)定構(gòu)象Fig.1 The most stable conformations of ginsenoside Re combined with cyclodextrins

3.2 主客體包合驅(qū)動力研究 將優(yōu)化后的配體分子人參皂苷Re 分別與不同受體分子環(huán)糊精置于晶胞內(nèi)，設(shè)置晶胞尺寸為3.13 nm，每個晶胞內(nèi)分別置入7 個受體分子、7 個配體分子。以伽馬環(huán)糊精與人參皂苷Re 的結(jié)合為例，晶胞見圖2A，包合過程中能量變化及分布見圖2B。

圖2 伽馬環(huán)糊精與人參皂苷Re 建立的晶胞（A） 及恒溫恒壓模擬的能量分布（B）Fig.2 Unit cell established by gamma-cyclodextrin and ginsenoside Re （A） and energy distribution under constant temperature and constant pressure simulation （B）

由圖2B 可知，伽馬環(huán)糊精與人參皂苷Re 結(jié)合時的勢能大于非鍵能曲線，后者包括氫鍵作用力、疏水作用力、靜電作用等，即兩者結(jié)合時勢能大于氫鍵作用、疏水作用之和。再分別計算配體分子人參皂苷Re 與受體分子在25、37 ℃下勢能、非鍵能、結(jié)合的總能量［18-20］，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re 在環(huán)糊精結(jié)合時的主要作用力均為勢能，屬于分子間作用力，即為包合過程的驅(qū)動力［21-23］。

3.3 相溶解度圖繪制及參數(shù)計算 為了驗證分子動力學(xué)計算結(jié)果，測定客體分子人參皂苷Re 在環(huán)糊精中的相溶解度，在203 nm 波長處測定吸光度。以人參皂苷Re 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得方程為Y＝8 090.4X-1 190.1 （r＝0.999 5），在0.10～20 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取不同質(zhì)量濃度人參皂苷Re 溶液適量，進樣分析，測得日內(nèi)、日間峰面積RSD 均小于1%，表明該方法精密度良好。同一溶液在室溫下于0、6、12、24、48 取樣測定，測得峰面積RSD＜1%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。再以環(huán)糊精濃度為橫坐標(biāo)，人參皂苷Re 濃度為縱坐標(biāo)繪制相溶解度曲線，見圖3。

圖3 人參皂苷Re 與環(huán)糊精的相溶解度曲線Fig.3 Phase solubility curves for ginsenoside Re and cyclodextrins

由此可知，隨著環(huán)糊精濃度增加，人參皂苷Re 濃度升高，主體分子與人參皂苷Re 之間的包合比例為1 ∶1，均屬于AL型［12-15］。根據(jù)公式Ks＝Slope/S0（1-Slope） 計算環(huán)糊精與人參皂苷Re 的包合常數(shù)，其中S0表示水中不含環(huán)糊精時的人參皂苷Re 溶解度（在25、37 ℃下分別為0.426、0.517 mmol/L），再根據(jù)Ks計算吉布斯自由能ΔG，公式為ΔG＝-RTlnKs（R＝8.314 J/mol，T＝t＋273，t分別為25、37 ℃），見表2。

表2 人參皂苷Re 相溶解度參數(shù)Tab.2 Phase solubility parameters for ginsenoside Re

結(jié)果顯示，在不同溫度下各環(huán)糊精對人參皂苷Re 的相溶解度趨勢一致，均依次為伽馬環(huán)糊精＞貝塔環(huán)糊精＞羥丙基伽馬環(huán)糊精＞羥丙基貝塔環(huán)糊精＞阿爾法環(huán)糊精，即伽馬環(huán)糊精對該成分的包合效果最好； 貝塔環(huán)糊精對人參皂苷Re 的相溶解度低于伽馬環(huán)糊精，但高于羥丙基貝塔環(huán)糊精； 雖然羥丙基貝塔環(huán)糊精和羥丙基伽馬環(huán)糊精在結(jié)構(gòu)上均有親水的結(jié)構(gòu)羥丙基，但對該成分的包合作用并沒有增加。對比圖1 可知，由于受到羥丙基空間位阻的影響，阻止了人參皂苷Re 在空腔內(nèi)的嵌合，故羥丙基貝塔環(huán)糊精對該成分的包合能力變差，進一步印證了理論計算結(jié)果與實驗測定結(jié)果的一致性。

另外，阿爾法環(huán)糊精、貝塔環(huán)糊精在37 ℃下相溶解度分別是在25 ℃下的1.02、1.09 倍，而羥丙基貝塔環(huán)糊精、羥丙基伽馬環(huán)糊精分別增加至1.57、1.68 倍，表明升高包合反應(yīng)溫度有利于包合過程，與理論計算結(jié)果一致。

4 討論與結(jié)論

5 種主體分子環(huán)糊精均可與人參皂苷Re 自發(fā)形成包合過程，并且溫度升高有利于包合反應(yīng)形成，其中伽馬環(huán)糊精、貝塔環(huán)糊精的包合能力更強，是理想的包合材料，而溶解度更好的羥丙基伽馬環(huán)糊精、羥丙基貝塔環(huán)糊精由于空間位阻的影響導(dǎo)致包合能力降低。本實驗采用ONIOM 分層算法優(yōu)化主客體分子的包合過程，既保持了量子力學(xué)中從頭計算方法在性質(zhì)預(yù)測和反應(yīng)計算中的可靠性，又具備了分子力學(xué)在大分子體系中計算快速的特性，所得結(jié)果與實際檢測情況一致，表明可通過Gaussian 計算方法來對包合過程反應(yīng)趨勢和包合能力進行預(yù)測。

綜上所述，本實驗采用理論計算結(jié)合實驗研究來對人參皂苷Re 與5 種常見環(huán)糊精的包合過程進行考察，獲得清晰的主-客體包合模式，并分別在理論和實驗層面闡述伽馬環(huán)糊精改善人參皂苷Re水溶性、穩(wěn)定性的優(yōu)勢，可為超分子藥物定量構(gòu)效關(guān)系的探討提供理論依據(jù)和實驗參考。