段嫏環(huán)，李起慧，呂 冬，汪 勇，崔秀明，2，*

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省三七資源可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650500； 3.云南省三七研究院，云南 昆明 650500）

三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen 的干燥根及根莖［1］，作為“生熟異用” 類中藥的典型代表具有“生打熟補(bǔ)” 之說［2］，即生三七能止血活血、消腫定痛，而熟三七具有補(bǔ)血理血、強(qiáng)身健體之功［3］，臨床主要用于治療貧血、失血虛弱、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡血不盡等疾病［4］。熟三七炮制工藝有焙、炒、蒸、油炸、砂燙、發(fā)酵、微波等［5-6］，目前通行方法為蒸制［7］，而以鮮品切片，蒸制后再進(jìn)行干燥的紅三七加工方法具有加工時間短、節(jié)約能源、適宜于產(chǎn)地趁鮮加工等優(yōu)點，對提升該藥材產(chǎn)地加工水平、增加產(chǎn)區(qū)地方經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義，但鮮有關(guān)于其加工工藝、藥理活性的報道。因此，本實驗優(yōu)化紅三七炮制工藝，并評價其補(bǔ)血活性，以期為該藥材產(chǎn)地趁鮮加工、飲片開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 三七皂苷 R1（ 批號YZ0220222，純度≥98%），人參皂苷Rg1（批號YZ112620，純度≥98%）、Rb1（批號YZ081920，純度≥98%）、Rk3（批號 YZ071623，純度≥98%）、Rh4（ 批號 YZ070721，純度≥98%），20 （R）-人參皂苷Rg3（批號YZ041522，純度≥98%） 對照品均購自南京源植生物科技有限公司；乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。復(fù)方阿膠漿購自東阿阿膠股份有限公司； 鮮三七（批號20211001） 采挖于云南丘北縣，經(jīng)昆明理工大學(xué)崔秀明研究員鑒定為五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng（Burk.） F.H.Chen 的根及根莖。甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Sigma公司； 水為純凈水。

1.2 動物 SPF 級雄性KM 小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，6～7 周齡，購自斯貝福（北京） 生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （京）2019-0010。動物實驗經(jīng)昆明理工大學(xué)實驗動物管理倫理委員會批準(zhǔn)［使用許可證號SYXK （滇）K2021-0003］。

1.3 儀器 LC2030 plus 高效液相色譜儀（日本島津公司）； 101-113 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市宏諾儀器有限公司）； YXQ-LS-100SII-01-00 壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）； DFY-500 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市工大機(jī)械有限公司）； HF3800 血常規(guī)分析儀（山東海力孚企業(yè)管理有限公司）； BL10-250A 超聲波清洗機(jī)（上海比朗儀器制造有限公司）； AL-104 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 飲片制備 取10 kg 鮮三七主根，經(jīng)撿選、清洗、切片后均勻分成2 份，一份置于高壓滅菌鍋中蒸制4 h 后干燥，制得紅三七飲片； 另一份干燥，常壓蒸制3 h 后再干燥，制得熟三七飲片。

2.2 評價指標(biāo)測定 根據(jù)課題組前期研究［8-9］，選擇生三七中主要皂苷成分（三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb1） 和熟三七中補(bǔ)血相關(guān)皂苷成分［10］［人參皂苷Rk3、Rh4及20 （R） -人參皂苷Rg3］總含量（Y） 作為評價指標(biāo)，采用HPLC 法測定。分析采用Pntulips RSZG-C18Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0 ～25 min，20% B； 25 ～30 min，20% ～25%B； 30 ～41 min，25% ～41% B； 41 ～55 min，41% ～55% B； 55 ～80 min，55% ～74% B； 80～82 min，74% ～100% B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長203 nm； 進(jìn)樣量10 μL。將“2.1” 項下2 種飲片打粉，按文獻(xiàn)［11］ 報道測定單體總皂苷含量。

2.3 單因素試驗 選擇蒸制溫度［12］、蒸制時間［13］、烘干時間［14］、烘干溫度［15］作為影響因素，單體總皂苷含量（Y） 作為評價指標(biāo)。

2.3.1 蒸制溫度 取鮮三七切片適量，置于高壓滅菌鍋中，固定蒸制時間4 h，烘干溫度50 ℃，烘干時間48 h，測定蒸制溫度90、100、110、120、130 ℃時總皂苷含量，結(jié)果見圖1A。由此可知，總皂苷含量隨著蒸制溫度增加而升高，在130 ℃時達(dá)到最大值，考慮到生產(chǎn)條件限制，最終選擇130 ℃作為蒸制溫度考察范圍。

圖1 各因素對總皂苷含量的影響Fig.1 Effects of various factors on total saponin content

2.3.2 蒸制時間 取鮮三七切片適量，置于高壓滅菌鍋中，固定蒸制溫度130 ℃，烘干溫度50 ℃，烘干時間48 h，測定蒸制時間0.5、1、2、4、6、8 h 時總皂苷含量，結(jié)果見圖1B。由此可知，總皂苷含量隨著蒸制時間延長先升后降，在4 h 時達(dá)到最大值，最終選擇2～6 h 作為蒸制時間考察范圍。

2.3.3 烘干溫度 取鮮三七切片適量，置于高壓滅菌鍋中，固定蒸制溫度130 ℃，蒸制時間4 h，烘干時間48 h，測定烘干溫度40、50、60、70、80 ℃時總皂苷含量，結(jié)果見圖1C。由此可知，總皂苷含量隨著烘干溫度增加先升后降，在60 ℃時達(dá)到最大值，最終選擇50 ～70 ℃作為烘干溫度考察范圍。

2.3.4 烘干時間 取鮮三七切片適量，置于高壓滅菌鍋中，固定蒸制溫度130 ℃，蒸制時間4 h，烘干溫度50 ℃，測定烘干時間12、24、36、48、60、72 h 時總皂苷含量，結(jié)果見圖1D。由此可知，總皂苷含量隨著烘干時間延長先升后降，在48 h時達(dá)到最大值，最終選擇24～60 h 作為烘干時間考察范圍。

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 參考文獻(xiàn)［16］ 報道，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以蒸制時間（A）、烘干溫度（B）、烘干時間（C） 為影響因素，總皂苷含量（Y） 為評價指標(biāo)，設(shè)計三因素三水平共17組試驗，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken 響應(yīng)面法因素水平Tab.1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results for Box-Behnken response surface method

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得方程為Y＝8.54-0.11A＋0.034B-0.09C＋0.16AB- 0.098AC- 0.074BC- 1.49A2-0.25B2-0.43C2，方差分析見表3。由此可知，模型F＝23.56，P＝0.000 2，具有高度顯著性； 失擬項F＝0.72，P＝0.591 8，決定系數(shù)R2＝0.968 0，校正決定系數(shù)，表明擬合程度良好，相對誤差小，可用于預(yù)測分析； 各因素影響程度依次為蒸制時間（A） ＞烘干時間（C） ＞烘干溫度（B）。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results for analysis of variance

響應(yīng)面分析見圖2。由此可知，隨著蒸制時間延長、烘干溫度增加，總皂苷含量先升后降，蒸制時間變化曲面比烘干溫度陡峭，等高線沿前者方向的變化相對密集，對響應(yīng)值峰值的影響更大； 蒸制時間變化曲面比烘干時間陡峭，表明前者對響應(yīng)值峰值的影響大于后者； 烘干溫度、烘干時間變化曲面坡度相差不大，兩者交互作用不明顯。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

最終確定，最優(yōu)工藝為蒸制時間4.86 h，烘干溫度62.27 ℃，烘干時間45.92 h，總皂苷含量為8.24%，為了便于后續(xù)操作，將其修正為蒸制時間4 h，烘干溫度60 ℃，烘干時間48 h。取同一批鮮三七切片，按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗證試驗，測得總皂苷平均含量為8.326%，RSD 為0.087%，與預(yù)測值8.24%接近（相對偏差4.3%），表明該工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)。

2.5 紅三七、熟三七總皂苷含量及其活性比較

2.5.1 總皂苷含量比較 HPLC 對照圖譜見圖3，含量測定結(jié)果見圖4。由此可知，與熟三七比較，紅三七能提高單體總皂苷含量； 紅三七中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1、Rk3、Rh4，20 （R） -人參皂苷Rg3皂苷總含量為8.33%，較熟三七（7.40%） 提高了約12.5%，其中人參皂苷Rk3、20 （R） -人參皂苷Rg3作為補(bǔ)血活性的指標(biāo)成分，在紅三七中的含量明顯升高，達(dá)7.42%，表明紅三七加工工藝比熟三七加工工藝更具有合理性。

圖3 熟三七與紅三七HPLC 對照圖譜Fig.3 HPLC reference chromatograms of steamed Notoginseng Radix et Rhizoma and red Notoginseng Radix et Rhizoma

圖4 紅三七、熟三七總皂苷含量比較Fig.4 Comparison of total saponin contents between red Notoginseng Radix et Rhizoma process and steamed Notoginseng Radix et Rhizoma

2.5.2 補(bǔ)血活性比較 參考文獻(xiàn)［17］ 報道，將90 只小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，紅三七高、中、低劑量組（1.2、0.6、0.3 g/kg），熟三七高、中、低劑量組 （1.2、0.6、0.3 g/kg），陽性組（30 mg/kg 復(fù)方阿膠漿），每組10 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺生理鹽水0.1 mL/10 g （劑量0.08 g/kg），每天1 次，連續(xù)3 d。建模成功后，給藥組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，空白組、模型組小鼠灌胃給予生理鹽水（0.2 mL/20 g），連續(xù)14 d。

末次給藥24 h 后，采用摘眼球取血法將小鼠血液收集到無菌、含EDTA 的離心管中，檢測血液白細(xì)胞 （WBC）、紅細(xì)胞 （RBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT） 水平［18］，結(jié)果見圖5。由此可知，與空白組比較，模型組小鼠血液WBC、RBC、Hb、PLT 水平降低 （P＜0.05，P＜0.01），表明模型建立成功； 與模型組比較，紅三七、熟三七各劑量組小鼠血液WBC、RBC、Hb、PLT 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），表明兩者具有補(bǔ)血活性，其中紅三七高劑量組貧血關(guān)鍵性指標(biāo)RBC、Hb 水平最高，與陽性組接近。

圖5 紅三七、熟三七對小鼠血常規(guī)的影響Fig.5 Effects of red Notoginseng Radix et Rhizoma and steamed Notoginseng Radix et Rhizoma on mouse blood routines

將小鼠頸椎脫臼處死，分離脾臟、胸腺，置于干凈濾紙上，稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)［19］，結(jié)果見圖6。由此可知，與模型組比較，紅三七、熟三七各劑量組小鼠脾臟指數(shù)降低（P＜0.05），胸腺指數(shù)升高（P＜0.05），并且呈劑量依賴性； 在相同劑量下，紅三七組對胸腺、脾臟指數(shù)的改善效果優(yōu)于熟三七組，表明前者對小鼠免疫器官具有保護(hù)作用。

圖6 紅三七、熟三七對小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.6 Effects of red Notoginseng Radix et Rhizoma and processing Notoginseng Radix et Rhizoma on mouse organ indices

3 討論

紅參是中藥市場銷售的主要人參炮制品，其大補(bǔ)元氣的功效與炮制工藝密切相關(guān)，同時西洋參也開發(fā)出了相關(guān)產(chǎn)品［20］。三七作為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有“生打熟補(bǔ)” 之說，生三七粉及其提取物中的三七總皂苷在預(yù)防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病方面得到了廣泛應(yīng)用［21-23］，但熟三七補(bǔ)血作用很少得到開發(fā)，目前僅有粉劑 （包括藥品和飲片）、丸劑等少數(shù)產(chǎn)品，炮制工藝為采用干三七打粉后蒸制，可能會因操作不當(dāng)而影響療效，導(dǎo)致其應(yīng)用受限。本實驗發(fā)現(xiàn)，通過類似于紅參的炮制工藝對鮮三七進(jìn)行加工炮制來開發(fā)出紅三七飲片時，可提高人參皂苷Rk3、20 （R） -人參皂苷Rg3含量，提高其補(bǔ)血活性。

紅三七加工工藝以鮮三七為原料進(jìn)行高壓蒸制，在產(chǎn)地直接進(jìn)行處理，能減少傳統(tǒng)加工炮制過程中新鮮藥材的干燥環(huán)節(jié)，以及干燥后經(jīng)水浸潤再切片的浸泡環(huán)節(jié)，降低加工成本及藥材耗損，是實現(xiàn)產(chǎn)地飲片加工一體化的有效途徑。同時，趁鮮加工也可提高三七產(chǎn)地加工的工業(yè)化水平，是增加藥材產(chǎn)區(qū)地方財政收入的有效途徑和發(fā)展方向。