程雨婕，陳 旭，劉云華，黃志芳，陳 燕，劉玉紅，易進(jìn)海*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，中藥材品質(zhì)及創(chuàng)新中藥研究四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

黃芩主要有效成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮，其中黃芩素較黃芩苷有更強(qiáng)的生物活性，而且更易吸收，生物利用度更高［1-3］，故從黃芩中直接提取該成分具有更好的藥用價(jià)值。黃芩存在葡萄糖醛酸水解酶，主要催化黃芩苷水解形成黃芩素，屬于糖基水解酶家族79［4］，被命名為黃芩酶。課題組前期報(bào)道從黃芩中提取黃芩酶以酶解黃芩苷類成分，制備黃芩素和總苷元［5］，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上從黃芩莖葉這一地上部分廢棄物中提取葡萄糖醛酸水解酶（sbslGUS），研究其酶學(xué)特性，并篩選其轉(zhuǎn)化黃芩苷的條件，以期提高黃芩素收率，為相關(guān)高效生產(chǎn)提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配置四元泵、VWD 檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、工作站（美國(guó)Agilent 公司）； KQ-300 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）； FW-200 型高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）； SQP 型電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； JY-30002 型電子天平（廣州玉治儀器有限公司）； DZKW-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）； Integral-3 型超純水機(jī)（成都寶賽思科技有限公司）。

黃芩苷（純度95.4%，批號(hào)110715-201821）、黃芩素（純度97.9%，批號(hào)111595-201808） 對(duì)照品均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院； 黃芩苷對(duì)照品（純度85%，批號(hào)nkl201119038） 購自成都鈉鈳鋰生物科技有限公司。乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司）； 甲醇為色譜純（成都市科龍化工試劑廠）；甲酸為色譜純（成都市科龍儀器有限公司）； 其余試劑均為分析純； 水為超純水（超純水機(jī)制備）。

黃芩莖葉經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院李青苗研究員鑒定，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的莖葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 酶活性測(cè)定

2.1.1 測(cè)定條件 參考文獻(xiàn)［6］ 報(bào)道，以黃芩苷為底物。精密量取13.4 mmol/L pH 6.0 的黃芩苷溶液1 mL、0.02 mol/L pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL、sbslGUS 提取液0.5 mL，在45 ℃、pH 6.0 條件下反應(yīng)20 min，加入3 倍酶解體系量乙醇終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，70%乙醇超聲處理20 min，放置至室溫，70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，進(jìn)樣分析，計(jì)算酶活性（酶活性定義為在45 ℃、pH 6.0 條件下，每1 h催化酶解1 μmol 黃芩苷所需的酶量為1 U［7-8］，結(jié)果以生藥計(jì)，單位為U/g）。

2.1.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相0.1% 甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0～8 min，50%B； 8 ～9 min，50% ～70%B； 9 ～20 min，70%B）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm； 進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按黃芩苷色譜峰計(jì)，應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素對(duì)照品適量，70%乙醇制成每1 mL 分別含兩者156.84、177.59 μg 的溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液制備 同“2.1.1” 項(xiàng)。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密移取對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%乙醇定容，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液適量，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為0.14%、1.11%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為0.12%、1.83%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.4” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得黃芩素、黃芩苷含量RSD 分別為1.73%、1.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的供試品溶液6 份，加入適量對(duì)照品溶液，混勻，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，黃芩苷、黃芩素平均加樣回收率分別為99.63%、100.25%，RSD 分別為1.97%、1.92%。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 篩選 參照文獻(xiàn)［6-9］ 報(bào)道的方法，并略加改進(jìn)。將干燥黃芩莖葉粉碎，過40 目篩，稱取3 份，每份50 g，第1 份加24 倍量水，在45 ℃下水浴浸提12 h； 第2 份分別加14、10 倍量水，室溫?cái)嚢杼崛? 次，每次30 min； 第3 份分別加14、10 倍量磷酸緩沖鹽溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），室溫?cái)嚢杼崛? 次，每次30 min，8 000 r/min 離心8 min，即得提取液，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性。結(jié)果，3 份提取液酶活性分別為460、1 322、1 401 U/g，表明水浴浸提后酶活性最低，而水或磷酸緩沖鹽溶液室溫?cái)嚢杼崛『筝^高，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，最終確定為用水?dāng)嚢杼崛　?/p>

2.2.2 正交試驗(yàn) 在“2.2.1” 項(xiàng)下結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇粒度（A，10、20、40 目）、加水量（B，8、10、12 倍）、提取時(shí)間（C，15、30、45 min）、提取次數(shù)（D，1、2、3 次） 作為影響因素，酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34） 正交試驗(yàn)表，結(jié)果見表2，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為A＞D＞C＞B，最優(yōu)水平為A3B2C1D3； 因素A有顯著影響（P＜0.05），B、C、D無顯著影響（P＞0.05）。最終確定，最優(yōu)提取工藝為黃芩莖葉粉碎后過40 目篩，室溫下加10 倍量水（第1 次多加4 倍藥材吸水量） 攪拌提取3 次，每次15 min，8 000 r/min 離心8 min，合并上清液。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results for orthogonal tests

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results for analysis of variance

按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得酶活性分別為1 621、1 554、1 610 U/g，平均值為1 595 U/g （RSD＝2.27%），表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究 參考文獻(xiàn)［10-12］ 報(bào)道。

2.3.1 底物濃度、動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 分別配制2.2、4.3、6.5、8.6、10.8 mmol/L 黃芩苷溶液，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，考察底物濃度與酶解速度的關(guān)系，結(jié)果見圖2，再通過Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，計(jì)算最大反應(yīng)速率Vmax、米氏常數(shù)Km（Km表示酶與底物結(jié)合的難易程度，其數(shù)值越小，底物與酶的親和力越大），結(jié)果見圖3。由此可知，底物濃度與酶解速度的關(guān)系符合酶促動(dòng)力學(xué)，擬合方程為Y＝0.000 09X＋0.014 2 （R2＝0.994 2，其中X為1/［S］，Y為1/V），Vmax為70.42 μmol/h，Km為0.006 3 mol/L。

圖2 底物濃度與酶活性的關(guān)系Fig.2 Relationship between substrate concentration and enzymatic activity

2.3.2 pH 值對(duì)酶活性的影響 使sbslGUS 酶解體系分別處于不同pH 值 （4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0） 環(huán)境中，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，以100%為最高值計(jì)算相對(duì)酶活性，結(jié)果見圖4。由此可知，最適pH 值為6.0，與文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道接近； 酶活性在pH 值5.54 ～6.55 下較高，并且過高或過低都會(huì)影響酶構(gòu)象，從而影響其與底物的結(jié)合能力，導(dǎo)致其活性降低［14］。

圖4 pH 值對(duì)酶活性的影響Fig.4 Effect of pH value on enzymatic activity

2.3.3 pH 穩(wěn)定性研究 將sbslGUS 分別置于不同pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0） 下保持4、8、12、24、36 h 后立即取出，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，結(jié)果見圖5。由此可知，sbslGUS 在pH 4.0～7.0 范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，36 h 內(nèi)相對(duì)酶活性均大于85%。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)sbslGUS pH 穩(wěn)定性Fig.5 pH stabilities for sbslGUS at different time points

2.3.4 溫度對(duì)酶活性的影響 固定pH 值6.0，在不同溫度 （4、20、30、40、45、50、55、60、70 ℃） 下按 “2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，以100%為最高值計(jì)算相對(duì)酶活性，結(jié)果見圖6。由此可知，酶活性在4 ～45 ℃下呈緩慢升高的趨勢(shì)，以40～60 ℃更明顯，但60 ℃后明顯降低，最終確定為45 ℃。

圖6 溫度對(duì)酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on enzymatic activity

2.3.5 熱穩(wěn)定性研究 將sbslGUS 分別置于不同溫度下保持一定時(shí)間（4、30 ℃下保持4、8、12、24、48 h，45、50、60 ℃下保持0.5、1、2、3、4 h），于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，以最初提取的酶活性為100%計(jì)算相對(duì)酶活性，結(jié)果見圖7。由此可知，sbslGUS 在4 ～30 ℃下熱穩(wěn)定性較高，45 ℃下逐漸降低，50 ℃以上后明顯降低。

圖7 不同溫度sbslGUS 熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stabilities for sbslGUS at different temperatures

2.3.6 金屬離子對(duì)酶活性的影響 將sbslGUS 分別與不同濃度（10、50、100 mmol/L） 金屬離子（Na＋、K＋、Cu2＋、Mg2＋、Ca2＋） 等體積混合后，室溫靜置1 h，按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定酶活性，以同等條件下sbslGUS 與等體積去離子水混合后的酶活性為100%計(jì)算相對(duì)酶活性，結(jié)果見圖8。由此可知，Na＋、K＋、Ca2＋、Mg2＋對(duì)酶活性影響不大，而Cu2＋能激活酶活性，并且作用隨著其濃度升高而增強(qiáng)，在100 mmol/L 時(shí)提高了約300%。

圖8 金屬離子對(duì)酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ion on enzymatic activity

2.4 實(shí)際應(yīng)用研究 參考文獻(xiàn)［15-17］ 報(bào)道，用sbslGUS 酶解黃芩苷以制備黃芩素。

2.4.1 供試品溶液制備 精密量取268.8 mmol/L黃芩苷溶液1 mL，加入適量sbslGUS 提取液，磷酸緩沖鹽溶液補(bǔ)充至4 mL，在上述條件下酶解反應(yīng)一定時(shí)間，加入3 倍酶解體系量乙醇終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加70%乙醇超聲處理20 min，放置至室溫，70% 乙醇定容至刻度，精密量取1 mL，置于50 mL 量瓶中，70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。然后，在“2.1.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算黃芩苷酶解轉(zhuǎn)化率，公式為轉(zhuǎn)化率＝ ［m2×M1/（m1×M2）］×100%，其中m1為黃芩苷實(shí)際投入量，m2為黃芩素實(shí)際測(cè)得量，M1為黃芩苷相對(duì)分子質(zhì)量，M2為黃芩素相對(duì)分子質(zhì)量。

2.4.2 pH 值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入不同pH 值的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，使酶解體系pH 值分別為5.0、5.5、5.8、6.0、6.5，反應(yīng)12 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為20.61%、71.86%、95.19%、95.25%、90.68%，最終確定為6.0。

2.4.3 溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，分別在30、40、45、50、55 ℃下反應(yīng)12 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為83.03%、89.33%、97.25%、48.14%、34.02%，最終確定為45 ℃。

2.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液、sbslGUS 提取液各1 mL，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液2 mL，置于45 ℃水浴鍋中，分別酶解2、4、8、10、12、24 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別 為 33.73%、55.32%、90.58%、94.03%、98.01%、98.19%，最終確定為12 h 以上。

2.4.5 底物初始濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 黃芩苷與sbslGUS 提取液按0.269 mmol/1 mL 比例，加入pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液，制成黃芩苷濃度分別為22.4、44.8、67.2、89.6、112 mmol/L 的溶液，置于45 ℃水浴鍋中酶解12 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為97.75%、98.26%、97.95%、95.68%、78.37%，符合酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說，為了提高生產(chǎn)效率和黃芩苷轉(zhuǎn)化率，最終確定為67.2 mmol/L。

2.4.6 加酶量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 參考文獻(xiàn)［8］報(bào)道，精密量取268.8 mmol/L 黃芩苷溶液1 mL，分別加入sbslGUS 提取液0.25、0.5、1、1.25、1.5 mL，pH 6.0 的磷酸緩沖鹽溶液補(bǔ)足至4 mL，45 ℃水浴酶解12 h，按“2.4.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果分別為30.37%、60.34%、95.67%、96.19%、96.53%，表明加酶量達(dá)到1 mL 時(shí)酶含量已經(jīng)趨飽和，最終確定為1 mL/0.269 mmol 黃芩苷。

2.4.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.4.2” 至“2.4.6” 項(xiàng)下結(jié)果，得到最優(yōu)制備工藝為pH 值6.0，溫度45 ℃，反應(yīng)時(shí)間12 h 以上，底物初始濃度67.2 mmol/L，加酶量1 mL/0.269 mmol 黃芩苷。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得轉(zhuǎn)化率分別為97.50%、98.12%、97.86%，平均值為97.83%。

3 討論

3.1sbslGUS 提取工藝 本實(shí)驗(yàn)首先采用文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道的45 ℃浸泡提取黃芩糖苷酶，發(fā)現(xiàn)提取液酶活性遠(yuǎn)低于室溫?cái)嚢杼崛∷茫⑶宜崛?、緩沖鹽提取酶液活性差異不大，故采用實(shí)際生產(chǎn)中更方便的加水?dāng)嚢杼崛　Ｔ诤Y選sbslGUS 提取條件的單因素、正交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芩莖葉不同粉碎粒度對(duì)提取液酶活性有顯著影響，40 目明顯優(yōu)于20 目； 黃芩莖葉酶水提時(shí)間15 min 優(yōu)于30 min，推測(cè)可能是因?yàn)閟bslGUS 被快速提取后與水液中某種物質(zhì)（底物） 發(fā)生作用，從而時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性降低。

3.2sbslGUS 酶學(xué)性質(zhì) 目前，轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素的糖苷酶主要通過真菌培養(yǎng)、基因克隆等［13，19］，尚未發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉中葡萄糖醛酸水解酶制備的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，sbslGUS 以黃芩苷為底物時(shí)，最適酶活條件為pH 值6.0，溫度45 ℃，酶解符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，Km為0.006 3 mol/L，Vmax為 70.42 μmol/h。另外，Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋對(duì)sbslGUS 酶活性影響不大，而Cu2＋對(duì)其有很強(qiáng)的激活作用，但它會(huì)使黃芩苷酶解轉(zhuǎn)化率顯著降低，推測(cè)可能是因?yàn)辄S芩苷等黃酮類化合物與金屬離子螯合形成配合物，從而阻礙酶解反應(yīng)［15，20］。

3.3sbslGUS 實(shí)際應(yīng)用 本實(shí)驗(yàn)以黃芩苷酶解轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)sbslGUS 酶解pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度、加酶量等進(jìn)行考察，確定最佳反應(yīng)條件為黃芩苷初始濃度67.2 mmol/L，pH 值6.0，溫度45 ℃，sbslGUS 提取液加入量1 mL/0.269 mmol 黃芩苷，反應(yīng)時(shí)間不少于12 h，黃芩素產(chǎn)率達(dá)95%以上，可為黃芩苷類結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化和從天然植物中酶解提取生理活性更強(qiáng)的苷元類成分提供參考。