崔雨晴，馮文明，張 甦，沙禕煒

［鑒甄檢測技術(shù)（上海） 有限公司，上海 200131］

黃葵膠囊為單方制劑，組方藥材為黃蜀葵花，功效清利濕熱、解毒消腫［1］，具有抑制炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)、降低尿蛋白、減輕水腫、清除自由基、抗腎纖維化等作用，臨床廣泛用于糖尿病腎病濕熱癥、慢性腎炎的治療，療效確切［2-5］。研究表明，黃葵膠囊有效成分為黃酮［6］，雖然該類成分含量測定已有大量報(bào)道［7-16］，但目前該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍以槲皮素為定性鑒別指標(biāo)，缺乏專屬性；以金絲桃苷含量為定量分析指標(biāo)，成分單一，難以進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)黃葵膠囊中多元活性成分的特點(diǎn)［17］，建立黃酮類成分的定性鑒別、特征圖譜、含量測定方法，以期為該制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

ATS 4 全自動(dòng)點(diǎn)樣儀、Visualizer 2 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG 公司）； Waters Aquility UPLC H-class 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； Schmidbauer GmbH/P300H 超聲波清洗儀（德國Elma 公司）； MS204TS/02、XSE105DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； TLC Silica gel 60 F254 薄層板（德國Merck 公司）。金絲桃苷（批號(hào)111521-201809，純度 94.9%）、蘆丁 （ 批號(hào)100080-201811，純度91.7%）、異槲皮苷 （批號(hào)111809-201804，純度97.2%）、槲皮素 （批號(hào)100081-201610，純度99.1%） 對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷對(duì)照品（批號(hào)T01J11Z117171，純度98.5%） 購自上海源葉生物科技有限公司； 楊梅素對(duì)照品（批號(hào)6609，純度99.8%） 購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司； 槲皮素-3′-O-葡萄糖苷對(duì)照品（純度94.2%） 購自江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。黃葵膠囊由江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供（批號(hào)20061503、20061504、20061601、20061602、20061702、20061703、20061801、20061802、20062001、20062002、20080303、20080304、20080403、20080404、20080503、20080504）。二苯基硼酸-2-氨基乙酯［梯希愛（上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司］； 聚乙二醇（上海泰坦科技股份有限公司）。流動(dòng)相用乙腈（上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）、甲酸（美國Fisher公司） 均為色譜純； 供試品溶液制備、薄層展開劑用甲醇、乙醇、無水甲酸、二氯甲烷均為分析純； 水為超純水［由Master Touch-DUVF 綜合型超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司） 制備］。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別 取本品內(nèi)容物0.1 g，研細(xì)，加5 mL 甲醇超聲提取15 min，離心，上清液作為供試品溶液； 取棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每0.5 mL 含兩者各1 mg 的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液； 取蘆丁、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每0.5 mL 含三者各1 mg 的溶液，作為參照品溶液，吸取上述溶液各4 μL，點(diǎn)于同一高效硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-無水甲酸-水（8 ∶1 ∶1） 為展開劑，展開缸用濾紙預(yù)飽和20 min，展距6 cm，取出，晾干，在105 ℃下加熱3 ～4 min，先噴以10 g/L 二苯基硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液，再噴以50 g/L 聚乙二醇400 甲醇溶液，空氣中干燥3 ～4 min，在紫外光燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖在對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)位置上顯示相同顏色斑點(diǎn)。

圖1 黃葵膠囊TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Huangkui Capsules

2.2 UPLC 特征圖譜建立

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 Acquity UPLC BEH C18色譜柱 （150 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.05% 甲酸（B），梯度洗脫（0 ～2 min，12% ～15%A； 2 ～7 min，15%A；7 ～8 min，15% ～17% A； 8 ～13.5 min，17% A；13.5～17 min，17% ～30% A； 17 ～20 min，30% ～80%A； 20 ～21 min，80% ～95% A； 21 ～22 min，95% ～12%A； 22～25 min，12%A）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長360 nm； 進(jìn)樣量1.0 μL。理論塔板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)，不低于10 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對(duì)照品適量，70%乙醇制成每1 mL 含45 μg 該成分的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.05 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率380 W，頻率37 kHz） 處理30 min，放冷，70% 乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 取陰性樣品適量，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定 供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)7 個(gè)特征峰，以金絲桃苷為參照，2 號(hào)峰應(yīng)與對(duì)照品溶液峰保留時(shí)間對(duì)應(yīng)，相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)，規(guī)定值分別為0.95 （峰1）、1.09（峰3）、1.58 （峰4）、1.75 （峰5）、2.03 （峰6）、2.26 （峰7）。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 圖2 顯示，峰1 為蘆丁，峰2 為金絲桃苷，峰3 為異槲皮苷，峰4 為棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，峰5 為楊梅素，峰6 為槲皮素-3′-O-葡萄糖苷，峰7 為槲皮素，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分UPLC 色譜圖Fig.2 UPLC chromatograms of various constituents

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取本品（批號(hào)20061602） 適量，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，以金絲桃苷為參照，測得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0 ～0.11%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD 在0 ～0.60%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)20061602） 適量，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以金絲桃苷為參照，測得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.05% ～0.37% 范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積 RSD 在0.45% ～6.05%范圍內(nèi)（個(gè)別特征峰因其峰面積過小，導(dǎo)致相對(duì)峰面積偏大），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 中間精密度試驗(yàn) 由不同分析人員在不同檢驗(yàn)日期采用不同儀器，將同一份本品 （批號(hào)20061602） 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以金絲桃苷為參照，測得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.17% ～2.21%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD 在0.25% ～23.12% 范圍內(nèi)（個(gè)別特征峰因其峰面積過小，導(dǎo)致相對(duì)峰面積偏大），表明該方法中間精密度良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3” 項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)20061602） 適量，室溫下于0、3、6、9、12 h 在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以金絲桃苷為參照，測得各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.03% ～0.55% 范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積 RSD 在0.11% ～3.62%范圍內(nèi)，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.11 圖譜生成 采用上述方法建立16 批樣品UPLC 特征圖譜，以金絲桃苷為參照，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)特征峰在16 批樣品中均有體現(xiàn)，而且其相對(duì)保留時(shí)間均在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。

2.3 含量測定 采用一測多評(píng)法。

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 同“2.2.1” 項(xiàng)。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷對(duì)照品適量，70%乙醇制成每1 mL 分別含兩者45、65 μg 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約0.05 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取各對(duì)照品適量，加70%乙醇制成每1 mL 分別含金絲桃苷0.180 8 mg/mL、異槲皮苷0.122 5 mg/mL、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷0.528 7 mg/mL、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷0.109 5 mg/mL 的貯備液，精密量取適量，70%乙醇逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取本品（批號(hào)20061602） 適量，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.03%、0.04%、1.14%、0.06%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)20061602） 適量，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷含量RSD 分別為0.56%、0.56%、1.59%、1.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn) 由不同分析人員在不同檢驗(yàn)日期采用不同儀器，將同一份本品 （批號(hào)20061602） 按“2.3.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷含量 RSD 分別為1.57%、0.57%、2.22%、0.03%，表明該方法中間精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3” 項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)20061602） 適量，室溫下于0、3、6、9、12 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷峰面積RSD 分別為0.17%、0.22%、2.16%、0.56%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各成分含量已知的本品內(nèi)容物（批號(hào)20061602） 0.025 g，平行分為3 組（低、中、高組），每組3 份，分別精密加入對(duì)照品溶液（各成分質(zhì)量濃度分別為金絲桃苷0.044 3 mg/mL、異槲皮苷0.034 2 mg/mL、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷0.055 2 mg/mL、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷0.024 1 mg/mL） 5、10、15 mL，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-葡糖醛酸苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷平均加樣回收率分別為100.5%、99.3%、99.4%、98.7%，RSD 分別為 1.44%、1.55%、1.79%、1.46%。

2.3.10 相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間測定 取“2.3.4” 項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以金絲桃苷為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他2 種成分相對(duì)校正因子fk/s，公式為fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，同時(shí)計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間（RRT），結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative correction factors and relative retention time of various constituents

2.3.11 耐用性試驗(yàn)

2.3.11.1 相對(duì)校正因子 取“2.3.9” 項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液適量，分別考察不同儀器、色譜柱、水相、體積流量、柱溫、進(jìn)樣量對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表3 ～4，可知均無明顯影響（RSD＜4.0%）。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 不同水相、體積流量、柱溫、進(jìn)樣量對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different aqueous phases，volumetric flow rates，column temperatures and injection volumes on relative correction factors

2.3.11.2 相對(duì)保留時(shí)間 取“2.3.9” 項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液適量，分別考察不同儀器、色譜柱、水相、體積流量、柱溫、進(jìn)樣量對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響，結(jié)果見表5～6，可知儀器、水相、柱溫、進(jìn)樣量均無明顯影響（RSD ＜5%），而色譜柱、體積流量影響較明顯（RSD＞5%），建議固定色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），體積流量為0.3 mL/min。

表5 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

表6 不同水相、體積流量、柱溫、進(jìn)樣量對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.6 Effects of different aqueous phases，volumetric flow rates，column temperatures and injection volumes on relative retention time

2.3.12 樣品測定 取16 批樣品，按 “2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批 2 份，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法、一測多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果無明顯差異［相對(duì)平均偏差（RAD） ＜1%］。

表7 各成分含量測定結(jié)果（%，n＝2）Tab.7 Results for content determination of various constituents （%，n＝2）

3 討論

在黃葵膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，薄層鑒別指標(biāo)僅有槲皮素，缺乏專屬性，本實(shí)驗(yàn)參考《歐洲藥典》中黃蜀葵花薄層鑒別方法，優(yōu)化了供試品溶液制備方法、展開劑等條件，最終確定以棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷為指標(biāo)，其專屬性強(qiáng)，耐用性好，可實(shí)現(xiàn)有效成分鑒別的目的。

在建立黃酮類成分特征圖譜時(shí)，測定了蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、楊梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素含量，涵蓋了楊梅素、槲皮素、棉皮素3 種母核的黃酮類化合物［18］，可全面控制該類成分質(zhì)量。

在含量測定過程中，選擇含量較高的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷作為指標(biāo)，由于棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷母核結(jié)構(gòu)與其他3 種成分不一致，而且槲皮素-3′-O-葡萄糖苷對(duì)照品不易得到，故最終確定采用外標(biāo)法測定棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量，再以金絲桃苷為內(nèi)標(biāo)，采用一測多評(píng)法同時(shí)其他3 種成分含量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中的定性鑒別新增棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷2 種黃酮類成分，特征圖譜包含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、楊梅素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素7 種黃酮類成分，含量測定在原有金絲桃苷的基礎(chǔ)上增加異槲皮苷、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷3 種黃酮苷類成分，從而實(shí)現(xiàn)更全面地控制黃葵膠囊質(zhì)量的目的。