金 林，周祖英，周家華，遲明艷，鄭 林，黃 勇，3*，黃 聞

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 3.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形外科，貴州 貴陽 550001）

透骨香為杜鵑花科植物滇白珠Gaultheria leucocarpavar.yunnanensis的干燥全株，主要分布于云南、貴州、廣西、四川等地區(qū)，全株均可入藥，其性平、味辛，具有祛風(fēng)除濕、清熱解毒、散寒止痛等作用［1］。目前，關(guān)于透骨香抗炎鎮(zhèn)痛［2-3］、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［4-5］等藥理作用的報道較多，并且也是苗族民間治療類風(fēng)濕病的習(xí)用藥材［6］，但目前各省標準對于其用藥部位并不統(tǒng)一［1，7-8］。

目前，在透骨香質(zhì)量控制方面的研究除了TLC鑒別外，大多為理化鑒別［9］及其中單一成分或大類成分的含量測定，如總黃酮［10］、總酚酸［10］、槲皮素［11］、水楊酸甲酯［12］等，Wang 等［13］測定了透骨香中抗風(fēng)濕部分及其代謝產(chǎn)物的含量，但并未對其他成分進行分析； Liu 等［14］采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對透骨香和其他6 種滇白珠屬植物進行鑒定，但不能用于比較不同批次透骨香之間的質(zhì)量差異； 蒲健等［15］采用GC-MS 法檢測透骨香根、莖葉中化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)槲皮苷［16］、綠原酸［17］、滇白珠苷A［18］、原兒茶酸［18］、表兒茶素［18］、白珠樹苷［19］是其藥理活性、質(zhì)量控制的主要物質(zhì)。本實驗采用UPLC-MS/MS 法同時測定透骨香中原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A 的的含量，以期為提升該藥材質(zhì)量控制水平提供參考。

1 材料

1.1 儀器 ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀串聯(lián)Xevo TQS 三重四極桿質(zhì)譜儀，配置Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站（美國Waters 公司）； EL-204 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； 微量移液器（德國Eppendorf 公司）。

1.2 試劑與藥物 透骨香共38 批，具體見表1，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院劉春花副教授鑒定為杜鵑花科白珠樹屬植物滇白珠Gaultherialeucocarpavar.yunnanensis的干燥全草。綠原酸、原兒茶酸、槲皮苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201817、111538-201606、111538-201606）；表兒茶素對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AF8030805）； 白珠樹苷、滇白珠苷A 對照品（自制，批號20190233），純度均≥98%。其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇稀釋至10 mL，分別得含綠原酸1.020 g/L、原兒茶酸1.035 g/L、表兒茶素1.018 g/L、槲皮苷0.878 g/L、白珠樹苷1.030 g/L、滇白珠苷A 1.116 g/L 的貯備液，量取適量，分別稀釋至0.012、0.041、0.101、0.137、0.077、0.071 mg/mL，混合，2 倍稀釋法稀釋，即得，在-20 ℃下保存。

2.1.2 供試品溶液 取透骨香粉末（過40 目篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，50%甲醇補足減失的質(zhì)量，取5 mL 定容至25 mL，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2 UPLC-MS/MS 條件

2.2.1 色譜 Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動相水 （含0.1% 甲酸）（A） -乙腈（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脫（0 ～0.5 min，10% B； 0.5 ～2.5 min，10% ～40% B；2.5～4 min，40% ～90% B； 4 ～4.5 min，90% B；4.5 ～6 min，90% ～10% B）； 體積流量0.30 mL/min； 柱溫40 ℃； 進樣量1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電噴霧離子源； 毛細管電壓3.0 kV； 離子源溫度120 ℃； 噴霧氣、反吹氣N2； 脫溶劑氣體積流量650 L/h； 去溶劑化氣溫度350 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 模式，其他參數(shù)見表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶劑 （50% 甲醇） 各1 μL，在“2.2” 項條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，供試品、對照品溶液中各成分色譜峰保留時間一致，空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，在“2.2” 項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并以信噪比（S/N） ＝3 為檢測限，S/N＝10 為定量限，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.1” 項下對照品溶液適量，在“2.2” 項條件下進樣測定6 次，連續(xù)3 d，測得原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A 日內(nèi)精密度RSD 分別為1.1%、1.3%、2.1%、1.7%、1.1%、1.2%，日間精密度RSD 分別為1.9%、1.1%、2.3%、1.6%、1.5%、1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 項條件下進樣測定，測得原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A 峰面積RSD 分別為1.8%、2.6%、2.1%、1.8%、1.7%、2.8%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批本品（黔西1），按“2.1.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，測得原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A含量RSD 分別為1.4%、2.1%、1.2%、1.6%、2.3%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的本品適量，共6 份，精密加入對照品溶液適量，按“2.1.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷 A 平均加樣回收率分別為101.88%、101.34%、99.88%、99.93%、99.91%、98.76%，RSD 分別為2.5%、1.4%、1.2%、1.1%、1.0%、2.4%。

2.4 樣品含量測定 取38 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

2.5 層次聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）采用Ward 法，選擇歐幾里德距離作為度量，并按變量Z值得分標準化后進行HCA 分析，結(jié)果見圖2。由此可知，38 批樣品分為2 個主要簇Ⅰ、Ⅱ，簇Ⅰ包括根，簇Ⅱ包括地上部分，表明兩者所含成分有較大差異。

圖2 系統(tǒng)聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of system cluster analysis

PCA 分析以6 種成分為變量，載荷圖、得分圖分別見圖3A～3B。如圖3A 所示，表兒茶素、白珠樹苷、原兒茶酸剛好分布在3 個方向上，并且各自與原點的距離都較近，表明三者含量之間無相關(guān)性，可能是引起藥材質(zhì)量變化的重要因素。如圖3B 所示，不同地區(qū)根部藥材主要在成分2 （PC2）軸方向上發(fā)生縱向偏移，而不同地區(qū)地上部分藥材主要向第一象限偏移，可能與這些方向上的變量（如表兒茶素、白珠樹苷、原兒茶酸等） 有關(guān)，與圖3A 一致。另外，在成分1 （PC1） 方向上滇白珠苷A 與槲皮苷、綠原酸處在兩極，表明后兩者含量越高，前者含量越低，反之亦然，這種相關(guān)性明顯的變量將根和地上部分明顯區(qū)分成2 個部分； 對于表兒茶素、白珠樹苷、原兒茶酸而言，其含量對不同部位藥材成分含量的貢獻相近，總有1種成分會占據(jù)主導(dǎo)地位，而且與其他兩者無關(guān)，這種相關(guān)性不明顯的變量在很大程度上形成了不同地區(qū)同一部位藥材的質(zhì)量差異。

圖3 主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis diagrams

同時，白珠樹苷在地上部分中的含量［（2.127± 1.275） mg/g］ 高于在根中的含量［（1.318±1.075） mg/g］ （P＜0.05），并且在發(fā)生偏離批次的地上部分中其含量高于其他批次地上部分中，它們主要來自于畢節(jié)，由于當(dāng)?shù)匚挥谫F州西部地區(qū)，地勢比貴陽等中部地區(qū)高一千多米，年平均氣溫更低，推測上述環(huán)境可能更有利于該成分在地上部分的累積。除此之外，原兒茶酸、表兒茶素是不同批次藥材根所含成分發(fā)生偏移的主要因素，都勻產(chǎn)藥材中表兒茶素含量整體高于其他地區(qū)藥材中，當(dāng)?shù)匚挥谫F州南部緯度較低的地區(qū)，氣候更溫暖濕潤，推測上述環(huán)境可能更適合該成分在根中的累積； 原兒茶酸整體含量偏低，在其影響下得分發(fā)生偏移的主要是貴陽地區(qū)藥材根。

3 討論

3.1 分析方法選擇 UPLC-MS/MS 法具有選擇性強、靈敏度高、分離性能好等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方制劑成分定性定量分析、中藥材質(zhì)量控制等方面［20］，它可檢測含量較低的成分，而且多反應(yīng)監(jiān)測模式可很好地分離保留時間非常接近的化合物，互不影響［21］。本實驗首次采用該方法，在負離子掃描、MRM 模式下測定離子對，發(fā)現(xiàn)定量離子峰形良好，其他物質(zhì)無干擾，能準確分析待測成分。

3.2 分析條件優(yōu)化 本實驗考察了不同色譜柱［Waters BEH C18、Thermo Hypersil Gold （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）］、流動相 ［甲醇-水、乙腈-水、乙腈（含0.1%甲酸） -水（含0.1%甲酸）］、體積流量 （0.2、0.3、0.4 mL/min），發(fā)現(xiàn)采用Waters BEH C18色譜柱、流動相乙腈-水（含0.1%甲酸）、體積流量0.3 mL/min 進行梯度洗脫時，各成分色譜峰分離度、峰形較好。另外，各成分在負離子模式下的響應(yīng)均較高，故本實驗采用該監(jiān)測模式。

3.3 指標成分選擇 張穎等［16］對透骨香止瀉活性部位進行分析，鑒定出槲皮苷，推測它可能是發(fā)揮作用的主要成分之一。李曉等［17］發(fā)現(xiàn)，透骨香中綠原酸等4 種成分具有抗炎鎮(zhèn)痛活性，并對其進行含量測定。劉慧等［18］對金骨蓮膠囊及其組方單味藥材的HPLC 色譜圖進行比較，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、滇白珠苷A 是透骨香藥效成分。Wang 等［19］測定透骨香中7 種抗風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成分含量，發(fā)現(xiàn)白珠樹苷最高，達63.53 μg/mg。因此，本實驗選擇與透骨香藥理作用密切相關(guān)的原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A 作為指標成分。

4 結(jié)論

本實驗建立UPLC-MS/MS 法同時測定透骨香中原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、槲皮苷、白珠樹苷、滇白珠苷A 的含量，能較系統(tǒng)全面地研究不同來源、部位藥材之間的質(zhì)量差異，該方法準確可靠，專屬性強，易于操作，并發(fā)現(xiàn)白珠樹苷、表兒茶素、原兒茶酸可能是不同產(chǎn)地藥材產(chǎn)生差異的質(zhì)量標志物，可為其質(zhì)量標準研究提供參考。