趙志遠(yuǎn)，張金朋，趙 碩，劉媛媛

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院） 藥學(xué)院，山東 泰安 271016］

護(hù)肝片收載于2020 年版 《中國藥典》 一部［1］，由柴胡、五味子、板藍(lán)根等多味中藥組成［2］，主要用于治療各種原因?qū)е碌母喂δ苁軗p，方中五味子是其發(fā)揮養(yǎng)肝作用的主要藥味，物質(zhì)基礎(chǔ)是木脂素類化合物，對于神經(jīng)系統(tǒng)具有抗癲癇［3］、提高學(xué)習(xí)記憶能力［4］、鎮(zhèn)靜催眠［5］功能，對于消化系統(tǒng)具有保肝護(hù)膽［6］功效，此外還有著抗腫瘤［7］、延緩衰老［8］、抗病毒［9］、抗炎、免疫調(diào)節(jié)［10］作用。

現(xiàn)行藥典中護(hù)肝片“含量測定” 項(xiàng)下以五味子醇甲為評價(jià)指標(biāo)，而同一類化合物藥理作用相似，臨床使用時(shí)容易產(chǎn)生疊加效應(yīng)［11-12］。目前，木脂素含量測定方法主要包括HPLC 法、UPLC法、LC-MS 法等［13］，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法，與HPLC 法相比分離效率更高，耗時(shí)更短［14］，更適合中藥復(fù)雜成分的分離［15］，在提高效率的前提下，同時(shí)測定五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制、臨床用藥等效性研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Nexera X2 型超高效液相色譜儀，配置LC-30AD 型溶液輸送單元、SIL-30AC 型高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器、SPD-M30A 型光電二極管陣列紫外可見光檢測器、CTO-20AC 型柱溫箱（日本島津公司）； Direct-Q?8UV-R 型超純水系統(tǒng)（德國Merck 公司）； ES-E120A 型電子分析天平（天津德安特傳感技術(shù)有限公司）； KQ-600DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； Fresco21 型高速冷凍離心機(jī) ［賽默飛世爾科技 （中國） 有限公司］。

1.2 試劑與藥物 五味子醇甲（批號D1827017，純度≥98.00%）、五味子醇乙（批號F1508140，純度≥98.00%）、五味子甲素（批號D1911039，純度≥98.00%）、五味子丙素（批號D1608128，純度≥98.00%） 對照品均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 戈米辛J （批號G99633663，純度≥98.00%）、當(dāng)歸酰戈米辛 H （ 批號A43133661，純度≥98.00%） 對照品均購自上海吉至生化科技有限公司； 當(dāng)歸酰戈米辛Q 對照品（批號PCS-210329，純度≥98.00%） 購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司； 五味子酚對照品（批號C12256480，純度≥98.00%） 購自上海麥克林生化科技有限公司。護(hù)肝片 （批號202106114、202111015、202105212，糖衣片，片心重0.35 g）購自黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司。甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為純化水（由Direct-Q?8UV-R 型超純水系統(tǒng)制備）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 WELCH Ultimate ?-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）； 流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0 ～0.01 min，45%B； 0.01 ～1.2 min，45% ～53% B； 1.2 ～3 min，53% ～53.5% B； 3 ～10 min，53.5% ～55% B； 10 ～13 min，55% ～95%B； 13 ～15 min，95%B； 15 ～17 min，95% ～45%B； 17 ～21 min，45% B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長267 nm； 進(jìn)樣量6 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品五味子醇甲5 mg、五味子醇乙和五味子甲素各1.5 mg、當(dāng)歸酰戈米辛Q 和五味子丙素各0.5 mg、五味子酚0.2 mg、戈米辛J 0.3 mg、當(dāng)歸酰戈米辛H 1 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為五味子醇甲500 μg/mL、戈米辛J 30 μg/mL、五味子醇乙150 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛Q 50 μg/mL、當(dāng)歸酰戈米辛H 100 μg/mL、五味子酚20 μg/mL、五味子甲素150 μg/mL、五味子丙素50 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液 取本品3 片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取0.4 g，加入乙酸乙酯16 mL，超聲（功率600 W，溫度30 ℃） 提取30 min，放冷，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，在蒸發(fā)皿上75 ℃水浴蒸干，10 mL 甲醇超聲溶解，反復(fù)清洗蒸發(fā)皿，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對照品、供試品溶液及空白溶劑（甲醇） 適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣6 μL 測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分色譜峰峰形較好，均能達(dá)到基線分離（分離度均大于1.5），理論塔板數(shù)均不低于8 000，空白溶劑無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.2.1” 項(xiàng)下對照品溶液2.5、1、0.71、0.5、0.05 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得稀釋0、2、5、7、10、100 倍的線性工作液，取適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4” 項(xiàng)下稀釋2 倍的線性工作液適量，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.28%、0.49%、0.31%、0.30%、0.39%、0.62%、1.04%、1.04%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品（批號202106114） 適量，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.51%、0.80%、0.48%、0.53%、1.27%、1.26%、0.35%、1.19%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品 （批號202106114） 粉末6 份，每份0.4 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素峰面積RSD 分別為0.63%、1.05%、0.65%、0.36%、0.73%、0.90%、1.41%、1.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取本品 （批號202106114） 粉末0.2 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取1 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得各成分原有量分別為五味子醇甲23.24 μg、戈米辛J 2.63 μg、五味子醇乙5.85 μg、當(dāng)歸酰戈米辛H 3.95 μg、當(dāng)歸酰戈米辛Q 1.15 μg、五味子酚1.04 μg、五味子甲素9.82 μg、五味子丙素2.60 μg。精密量取上述供試品溶液9 份，每份1 mL，置于9 個(gè)5 mL 量瓶中，分別按50%、100%、150%水平加入對照品溶液各10 mL，平行3 份，分別取1 mL，置于9 個(gè)5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素平均加樣回收率分別為101.94%、97.56%、102.67%、101.58%、99.14%、96.84%、98.07%、96.02%，RSD 分別為0.62%、1.30%、1.45%、0.86%、0.76%、1.28%、1.14%、1.60%。

2.9 樣品含量測定 取3 批樣品（批號202106114、202111015、202105212，編號1 ～3） 粉末，每批0.4 g，按“2.2.2” 項(xiàng)下平行制備3 份供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2，可知各成分含量由高到低依次為五味子醇甲、五味子甲素、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子丙素、戈米辛J、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚。在中藥質(zhì)量控制評價(jià)模式中，五味子醇甲作為五味子糖漿質(zhì)量控制指標(biāo)，符合2020 年版《中國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)（RSD＜2%）。

表2 各成分含量測定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 討論

3.1 提取方法選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了80% 甲醇［16］、甲醇［17］超聲提取10、20、30 min，發(fā)現(xiàn)色譜圖中雜質(zhì)峰太多，無法對五味子木脂素進(jìn)行定量分析。綜合提取率等多種指標(biāo)，最終確定乙酸乙酯超聲提取30 min，揮干后甲醇溶解作為提取方法。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道，分別考察了WELCH Ultimate?-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC ? BEH-C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 色譜柱，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素在WELCH Ultimate?-C18色譜柱上色譜峰峰形、分離度均良好。再考察了流動相甲醇-水，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素出峰不完全，分離度不符合要求，而改用乙腈-水洗脫后出峰良好。然后，分別考察了0.1% 甲酸、0.1% 乙酸、0.1% 磷酸，發(fā)現(xiàn)加入0.1%甲酸后各五味子木脂素分離度良好，峰形對稱。

前期報(bào)道，木脂素檢測波長主要包括220 nm［19］、250 nm［20］、254 nm［21］。本實(shí)驗(yàn)在200 ～400 nm 波長處對對照品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)各五味子木脂素在267 nm 處基線平穩(wěn)，吸收最好，雜質(zhì)峰最少。再分別考察了柱溫（35、40、45 ℃）、體積流量 （0.28、0.3、0.32 mL/min）、進(jìn)樣量（4、6、8 μL），發(fā)現(xiàn)在柱溫40 ℃、體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量6 μL 下各五味子木脂素色譜峰峰形理想，可與周圍干擾物質(zhì)達(dá)到良好的分離效果。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC 法同時(shí)測定護(hù)肝片中五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、當(dāng)歸酰戈米辛Q、五味子酚、五味子甲素、五味子丙素的含量，該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，而且專屬性強(qiáng)，精密度好，可為后續(xù)該制劑及其所含木脂素類化合物的研究奠定基礎(chǔ)。