陳鲆，曾如奎，楊德英，哈西，羅文杰，徐丹，劉飛，秦云鑫，熊金鑫，丁文祥，黃俊杰，劉日，唐子婷，何智，嚴太明

（1.四川農業(yè)大學動物科技學院，成都 611130；2.長江上游魚類資源與環(huán)境四川省野外科學觀測研究站，成都 611130；3.雅礱江流域水電開發(fā)有限公司，成都 610051）

葉須魚屬（Ptychobarbus）是鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科中的一個類群，是伴隨著青藏高原隆起而逐漸進化形成的特化等級裂腹魚類。葉須魚屬起源于更新世早期，到中更新世其祖先種逐步消亡[1]。目前，世界上已報道了5種葉須魚屬魚類，包括中甸葉須魚（Ptychobarbus chungtienensis）、雙須葉須魚（P.dipogon）、裸腹葉須魚（P.kaznakovi）、修長葉須魚（P.leptosomus）和錐吻葉須魚（P.conirostris）。其中，中甸葉須魚僅在小中甸河和碧塔海水域中有發(fā)現(xiàn)[2]，已被列入《中國物種紅色名錄》，等級為瀕危（EN）[3]；雙須葉須魚分布于雅魯藏布江中游干支流中，為當地重要的經濟魚類之一[4]；裸腹葉須魚分布于怒江、瀾滄江、金沙江水系，被列入《中國物種紅色名錄》，等級為易危（VU）[3]。修長葉須魚是張春光團隊于2019年認定的新種[5]，現(xiàn)知僅分布于雅礱江上游干流及支流。錐吻葉須魚產于我國西藏阿里獅泉河和噶爾河，分布于印度河和赫爾曼德河上游各支流[6]，為產區(qū)主要經濟魚類之一[7]。由此可以看出，葉須魚屬魚類的分布范圍十分局限，而它們的親緣關系如何目前尚不清楚。

依據形態(tài)學特征對葉須魚屬不同種進行鑒定中發(fā)現(xiàn)，中甸葉須魚、裸腹葉須魚及修長葉須魚在形態(tài)上極為相似[5]，僅能從下唇分葉程度、體長/體高等[5]外部特征的細微不同進行區(qū)分，故容易造成鑒定結果出現(xiàn)較大差異[8]。而隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展和進步，篩選合適的分子標記開展物種鑒定，并結合傳統(tǒng)形態(tài)分類學的結果，將有助于確定物種分類地位的有效性[9-11]。同時利用分子標記也可以進一步分析物種的起源進化關系。有鑒于此，有必要篩選葉須魚屬魚類種間鑒定的分子標記，并開展其分子系統(tǒng)進化關系分析。

線粒體細胞色素b（cytochrome，cytb）基因具有進化速度較快、易擴增等優(yōu)點，通常用于確定物種間的遺傳關系[12-14]。核基因重組激活基因（recombination activating genes，rags）在脊椎動物中普遍存在，不同物種之間其堿基組成變化較少，在進化過程中非常保守，故近年來已廣泛運用于脊椎動物進化和親緣關系分析[15-18]。目前，常聯(lián)合cytb和rag2基因分析魚的種系發(fā)育遺傳關系。Zhang R.Y.等[19]利用cytb和rag2等基因分析裸鯉屬3種魚的系統(tǒng)地理演化發(fā)現(xiàn)，這3種魚的系統(tǒng)發(fā)育和形態(tài)學分析結果與演化收斂或逆轉過程最為相容。同時，Chen W.T.等[20]利用cytb和rag2等基因對瀾滄江裂腹魚（Schizothorax lantsangensis）、光唇裂腹魚（S.lissolabiatus）和云南裂腹魚（S.yunnanensis）的遺傳多樣性分析后發(fā)現(xiàn)，其種群分化與青藏高原更新世晚期的造山運動有關。由此可以看出，采用cytb和rag2基因研究葉須魚屬分子系統(tǒng)進化關系是可行的。有鑒于此，本文擴增了5種葉須魚的線粒體cytb基因序列，以及修長葉須魚和裸腹葉須魚的rag2序列，并基于此分析了物種間的系統(tǒng)發(fā)育關系和種內的遺傳多樣性水平。本研究結果為葉須魚屬內物種的分類提供分子標記，也能為該屬內物種保護措施的制定提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

依據《中國動物志》和《四川魚類志》等資料，開展?jié)O獲物的形態(tài)學鑒定，獲得葉須魚屬魚類30尾，并采集魚的部分鰭條用于總DNA的提取。其中，中甸葉須魚（BTH 1～ BTH 10）樣本由中國昆明動物研究所提供，采自云南省香格里拉市碧塔海；裸腹葉須魚樣本（OQ 1～ OQ 10）采集自金沙江一級支流偶曲白玉縣河段；修長葉須魚樣本（XSH 1～XSH 10）采集自雅礱江一級支流鮮水河爐霍縣河段。另外，38條葉須魚屬魚類cytb基因序列均來自于GenBank數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。樣本及序列信息詳見表1。

表1 采集樣本信息及cytb序列信息表Table1 The cytb sequences of four species in Ptychobarbus from GenBank database

1.2 DNA提取、擴增及測序

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（X0907，Tiangen BiotechCo., Ltd.）提取鰭條基因組總DNA。采用超微量核酸分析儀檢測DNA濃度，同時采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。使用已報道的引物擴增葉須魚屬cytb基因（上游引物：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，下游引物：5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′）[21]。根據葉須魚屬5個物種rag2基因共有保守區(qū)域，采用primer 5.0進行設計，上游引物：5′-GGCTGCGTGCC ATTTCAT-3′，下游引物：5′-GTAGGGCTCCCAGGT GTT-3′。PCR反應體系均為30.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 15.0 μL，DNA模板3.0 μL，上下游引物各1.5 μL，雙蒸水（ddH2O）9.0 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，然后循環(huán)34次，最后在72 ℃下延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，并將有目的條帶的PCR產物送往成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

1.3 數據分析

使用DNAstar軟件將測序獲得的序列拼接后，用MegAlign進行基因序列人工比對。用MEGA_11.0.13分析序列的核苷酸組成、群體內和群體間遺傳距離。同時，使用MEGA_11.0.13和MrBayes 3.1分別構建NJ(Neighbor-Joining Method)和貝葉斯（BI）系統(tǒng)進化樹。用DNASP 5.0軟件將群體分組，統(tǒng)計各物種中單倍型的分布、數量和多樣性，計算突變位點和核苷酸多樣性等。使用Arlequin 3.5軟件計算遺傳分化指數（Fst）和基因流（Nm）后，用SPSS21.0進行顯著性檢驗（P<0.05）。為更好地反映葉須魚屬魚類的遺傳分化情況，基于cytb的單倍型，用popArt 1.7軟件構建單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 cytb基因多態(tài)性分析

統(tǒng)計分析結果表明，獲得的68個葉須魚屬魚類樣本cytb基因序列全長為1 034 bp，不存在插入或缺失位點，共檢測到154個變異位點，占核苷酸總數的14.9%。其中，包括了11個單一多態(tài)位點（Singleton variable sites, NS）和143個簡約信息位點（Parsimony informative sites, NPi）（表2）。堿基組成分析顯示，T、C、A和G的平均含量分別為29.8%、29.0%、24.1%和17.0%，A+T含量（54.0%）高于G+C含量（46.0%）。

表2 cytb 基因多態(tài)性分析Table 2 Analysis of cytb polymorphism

2.2 基于cytb基因分析葉須魚屬系統(tǒng)發(fā)育關系

以齊口裂腹魚的cytb序列作為外群，構建的NJ和貝葉斯（BI）系統(tǒng)進化樹拓撲結構一致（圖1）。進化樹分析結果顯示，裸腹葉須魚和中甸葉須魚聚為一支，而修長葉須魚、雙須葉須魚及錐吻葉須魚形成另外一個較大的分支。其中，采自雅礱江一級支流鮮水河爐霍縣河段的XSH1～XSH10樣本與修長葉須魚聚為一支，采自云南省香格里拉市碧塔海的BTH1～BTH10樣本與中甸葉須魚聚為一支，而金沙江水系歐曲白玉縣河段OQ1～OQ10樣本與裸腹葉須魚聚為單獨的一支。由此可以得出，基于cytb基因序列的分析結果與形態(tài)鑒定結果完全一致，該分子標記能較好地區(qū)分葉須魚屬的各物種。

圖1 基于線粒體cytb基因序列構建的葉須魚屬魚類BI及NJ系統(tǒng)進化樹Figure 1 Construction of BI and NJ phylogenetic trees for the genus Ptychobarbus based on mitochondrial cytb gene sequences

2.3 葉須魚屬cytb基因遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，修長葉須魚單倍型多樣性最高（Hd=0.956），有8個單倍型；錐吻葉須魚單倍型多樣性最低（Hd=0.600），含2個單倍型。裸腹葉須魚核苷酸多樣性最高（Pi=0.007 51），中甸葉須魚苷酸多樣性最低（Pi=0.000 17）。雙須葉須魚和裸腹葉須魚的平均核苷酸差異系數（k=6.073，7.734）明顯高于其他物種，尤其是錐吻葉須魚（k=0.600）、中甸葉須魚（k=1.154）和修長葉須魚（k=2.667）（表3）。這些結果表明，葉須魚屬魚類各群體間遺傳多樣性大小差異較大，提示各物種間遺傳變異程度差異較大。

表3 葉須魚屬5個物種遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity index in five groups of Ptychobarbus

單倍型網絡圖顯示，中甸葉須魚共檢測出4個單倍型（Hap-1、Hap-2、Hap-3和Hap-4），錐吻葉須魚共檢測出2個單倍型（Hap-5和Hap-6），雙須葉須魚共檢測出7個單倍型（Hap-7～Hap-13），裸腹葉須魚共檢測出13個單倍型（Hap-14～Hap-26），修長葉須魚共檢測出8個單倍型（Hap-27～Hap-34），不同物種之間無共享單倍型。不同物種的單倍型構成一個支系，其中有一個支系包括修長葉須魚和錐吻葉須魚群體2個亞支（圖2）。這些結果表明，葉須魚屬魚類為5個獨立的進化支系。

圖2 基于cytb序列的葉須魚屬單倍型網絡結構圖Figure 2 Structure diagram of cytb sequence haplotype network of Ptychobarbus

2.4 基于cytb基因分析葉須魚屬物種的遺傳結構

種間遺傳距離分析結果表明，葉須魚屬魚類物種間遺傳距離位于0.019 7～0.083 8之間，已達到種的分化水平（表4）。其中，中甸葉須魚和雙須葉須魚種間的遺傳距離最大（D=0.083 8），裸腹葉須魚和中甸葉須魚種間的遺傳距離最?。―=0.019 7）。雙須葉須魚和裸腹葉須魚種內存在較弱的遺傳分化，遺傳距離均為0.01。

表4 葉須魚屬5個物種種間和種內的遺傳距離Table 4 Genetic distance of interspecific and intraspecific differences in five species of Ptychobarbus

表5 葉須魚屬5個物種種間遺傳分化指數（Fst）及基因流（Nm）Table 5 Pairwise fixation index Fst and gene flow Nm of interspecific and intraspecific differences in five species of Ptychobarbus

5種葉須魚種間的遺傳分化系數（Fst）及基因流（Nm）分析顯示，F(xiàn)st介于0.727 07～0.984 71（表6）。其中，中甸葉須魚與錐吻葉須魚種間遺傳分化系數最大（Fst=0.984 71），中甸葉須魚與裸腹葉須魚種間Fst最?。‵st=0.727 07）。5種葉須魚種間的Nm值大小為0.003 76～0.049 61。其中，中甸須葉須魚和錐吻葉須魚的Nm值最?。∟m=0.003 76），中甸葉須魚與裸腹葉須魚的Nm值最大（Nm=0.049 61）。表明5種葉須魚種間分化較大，基因交流較弱。

表6 rag2 基因多態(tài)性分析Table6 Analysis of rag2 polymorphism

2.5 裸腹葉須魚及修長葉須魚rag2基因多態(tài)性分析

對采集自金沙江流域的裸腹葉須魚（10尾）和雅礱江流域的修長葉須魚（10尾）進一步開展了rag2基因序列分析。共獲得20條rag2基因序列，全長為949 bp。在裸腹葉須魚群體內檢測到1個簡約信息位點，未檢測到單一多態(tài)位點。T、C、A、G的平均含量分別為24.1%、26.4%、24.0%和25.5%，G+C含量（51.9%）高于A+T含量（48.1%）（表6）。而在修長葉須魚群體內未檢測到簡約信息位點和單一多態(tài)位點。T、C、A、G的平均含量分別為24.1%、26.3%、24.1%和25.5%，G+C含量（51.8%）高于A+T含量（48.2%）（表6）。

2.6 基于rag2基因分析裸腹葉須魚及修長葉須魚系統(tǒng)發(fā)育關系

基于種間遺傳距離，以軟刺裸裂尻魚為外群，構建了裸腹葉須魚及修長葉須魚rag2基因的NJ和BI系統(tǒng)進化樹。結果表明裸腹葉須魚和修長葉須魚被明顯地分開，分別單獨聚為一支，這與cytb分析得到的結果一致（圖3）。

圖3 基于rag2基因序列構建的裸腹葉須魚及修長葉須魚BI及NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Figure3 Construction of BI and NJ phylogenetic trees for Ptychobarbus kaznakovi and P.leptosomus based on rag2 gene sequences

3 討論與結論

3.1 分子標記的篩選和確證

目前，線粒體cytb基因被廣泛應用于物種鑒定、分子進化、系統(tǒng)地理學和遺傳結構研究[22-25]，且與核基因rag2常被聯(lián)合用于魚類種系發(fā)育關系的分析，如裸鯉屬3種魚的系統(tǒng)地理學分析[19]、裂腹魚類的種群進化分析[20]。這些結果表明，cytb與rag2能用于物種有效性的確定。

本研究中，基于線粒體cytb基因構建了5種葉須魚的系統(tǒng)進化樹。裸腹葉須魚和中甸葉須魚聚為一大支，修長葉須魚、雙須葉須魚及錐吻葉須魚形成一個較大的分支，修長葉須魚和錐吻葉須魚形成一個小的分支。這一結果表明，cytb基因能夠將5種葉須魚從分子層面區(qū)分開。rag2基因也能將裸腹葉須魚和修長葉須魚能夠區(qū)分開來，與cytb分析得到的結果一致。由此可以得出，基于cytb與rag2的序列特征，能較好地對葉須魚屬魚類進行區(qū)分。

3.2 葉須魚屬魚類遺傳距離分析

遺傳距離大小反映了種間親緣關系的遠近，遺傳距離越大物種間遺傳分化越大[26]。Y.P.Kartavtsev[27]提出cytb基因在種內的基因遺傳距離水平在0.005～0.015之間，而本研究中5種葉須魚屬魚類物種間的遺傳距離變動于0.019 7～0.083 8，這表明其已達到種的分化水平。同時，本研究發(fā)現(xiàn)中甸葉須魚與裸腹葉須魚遺傳距離最?。―=0.019 7），從分子層面證實中甸葉須魚與裸腹葉須魚親緣關系最近。這與陳宜瑜等[1]通過形態(tài)特征分析，提出中甸葉須魚和裸腹葉須魚是一對具有很近的共同祖先的姐妹種的結論是一致的。中甸葉須魚歷史上分布于金沙江流域的小中甸河、那亞河、碧塔海、屬都湖和納帕海，本次采集樣本來自金沙江一級支流碩多崗河的支流[5]，而裸腹葉須魚主要分布在金沙江、瀾滄江、長江，本次樣本采集自金沙江上游一級支流偶曲。這表明，中甸葉須魚與裸腹葉須魚種間的親緣關系與地理位置有較大關聯(lián)。這些結果符合地理較近的物種有更近的親緣關系的說法[28]。

此外，中甸葉須魚與雙須葉須魚遺傳距離最大（D=0.083 8），表明中甸葉須魚與雙須葉須魚親緣關系較遠，可能與其分布的地理位置和海拔氣候有關。雙須葉須魚是分布于雅魯藏布江中游支流拉薩河和布拉瑪普特拉河的特有魚類[29]，種群聚類地位相對獨立，并且分布海拔較高，較遠的地理隔離導致中甸葉須魚與雙須葉須魚親緣關系較遠。這些結果進一步從分子層面證實，葉須魚屬是伴隨著青藏高原的隆起而逐漸進化形成的特化等級裂腹魚類。

3.3 葉須魚屬魚類遺傳多樣性水平

遺傳多樣性是生物進化和適應環(huán)境的基礎[28]。物種遺傳多樣性越豐富，對環(huán)境變化的適應能力就越強[30]，而遺傳多樣性的缺乏對生活在不平衡生態(tài)環(huán)境中的生物是一個巨大的威脅[31]。單倍型多樣性（Hd）及核苷酸多樣性（Pi）是衡量種群遺傳多樣性水平的重要指標[32-33]。W.Grant和B.Bowen[34]在沙丁魚（Sardina pilchardus）和鳳尾魚（Coilia mystus）的研究中發(fā)現(xiàn)，若單倍型多樣性（Hd）高于0.5且核苷酸多樣性（Pi）低于0.005，這表明該種群的遺傳多樣性水平低，可能是受瓶頸效應影響后，種群快速擴張所致。本研究結果顯示，修長葉須魚、中甸葉須魚以及錐吻葉須魚遺傳多樣性水平符合高單倍型多樣性（Hd>0.5）低核苷酸多樣性（Pi<0.005）的遺傳模式，推測可能是一個較小的種群在快速進化過程中，種群數量增加的同時單倍型多樣性也在提高，但沒有時間使得核苷酸發(fā)生變異[35]。而雙須葉須魚和裸腹葉須魚則呈現(xiàn)出高單倍型多樣性高核苷酸多樣性的遺傳模式。這些結果表明，葉須魚屬魚類存在較大的遺傳分化。

3.4 物種有效性鑒定

多年來，葉須魚屬魚類的分類問題一直是分類學家爭論的焦點，特別是中甸葉須魚、裸腹葉須魚和修長葉須魚。張春光等[5]對修長葉須魚做出了描述，認為修長葉須魚與中甸葉須魚在形態(tài)上十分相似，但它是區(qū)別于裸腹葉須魚及中甸葉須魚的有效種，并鑒定為新種。2020年，郭延蜀等在《四川魚類原色圖志》中指出，修長葉須魚應是中甸葉須魚的同物異名[8]。

遺傳分化系數是反映物種間遺傳分化程度的另一個重要指標。根據閆春梅等[36]關于細鱗魚4個群體遺傳多樣性分析研究的解釋，0.25

3.5 種質資源管理和保護建議

了解魚類的遺傳結構和物種多樣性現(xiàn)狀，有助于開展其種質資源評估[23]，進而為其保護策略的制定等提供基礎資料[37]。中甸葉須魚、修長葉須魚和錐吻葉須魚遺傳結構表明其進化潛力較低，對環(huán)境變化的適應能力很弱，存在著較大的滅絕風險。因此，應對修長葉須魚、中甸葉須魚和錐吻葉須魚優(yōu)先采取保護措施。而雙須葉須魚和裸腹葉須魚均是高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性的遺傳結構，表明其是由一個大而穩(wěn)定的種群經過了較長的歷史演化而來，對環(huán)境變化的適應能力較強，具有較大的遺傳選育潛力，更容易擴展其分布范圍和開拓新的環(huán)境[38]。因此，在保護葉須魚屬魚類種質資源的過程中，應優(yōu)先對中甸葉須魚、修長葉須魚和錐吻葉須魚開展保護工作。

綜上，本研究通過線粒體cytb基因序列分析了葉須魚屬魚類分子系統(tǒng)進化關系，研究結果支持葉須魚屬魚類分化為明確的5個物種；基于核基因rag2的分析結果表明金沙江流域的裸腹葉須魚以及雅礱江流域的修長葉須魚也達到了種的分化水平。雙須葉須魚和裸腹葉須魚的遺傳多樣性高于其他3種葉須魚屬魚類，應優(yōu)先對中甸葉須魚、修長葉須魚以及錐吻葉須魚開展保護工作。以上結果均表明，基于cytb和rag2基因可作為葉須魚屬種間的分子標記，本研究結果為該屬內物種分類鑒定、保護措施的制定等提供理論基礎和科學依據。