蔣文枰，程順，劉士力，鄭建波，遲美麗，杭小英，彭苗，李飛

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313001）

翹嘴鲌（Culter alburnusBasilewsky）俗稱白魚、白條，隸屬于鯉科，鲌亞科，鲌屬，是我國重要的淡水名優(yōu)經(jīng)濟(jì)魚類之一，以太湖產(chǎn)翹嘴鲌最負(fù)盛名，位列太湖三白之首[1]。具有生長快、肉質(zhì)鮮嫩的特點(diǎn)，廣泛分布于我國諸多水系[2-3]。雌魚生長速度明顯快于雄魚，培育翹嘴鲌全雌魚可提高單產(chǎn)水平[4]。采用群體選育、異源雌核發(fā)育誘導(dǎo)和偽雄魚誘導(dǎo)等育種技術(shù)，以太湖湖州段捕撈后經(jīng)以生長速度為目標(biāo)性狀的2代群體選育和2代異源雌核發(fā)育的翹嘴鲌子代為母本（XX），以利用性別控制技術(shù)誘導(dǎo)雌核發(fā)育翹嘴鲌子代獲得的生理性雄魚（XX′）為父本，經(jīng)交配繁殖獲得的F1，即為翹嘴鲌“全雌1號”，其生長速度較未經(jīng)選育的翹嘴鲌平均提高17.0%，雌性率為99.8%[4-6]。

水生動(dòng)物在水體中氨氮濃度低于耐受限度時(shí)，可進(jìn)行自行調(diào)節(jié)以適應(yīng)外界環(huán)境變化[7]；但當(dāng)受到的氨氮濃度過高或脅迫時(shí)間過長，超過機(jī)體調(diào)節(jié)閾值時(shí)，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)會受到破壞，抗氧化酶活性將下降，機(jī)體器官受損[8-9]。因此有必要對不同氨氮濃度和不同脅迫時(shí)間條件下魚類組織器官以及抗氧化酶活性變化開展研究，以探討在氨氮脅迫過程中魚類的氧化應(yīng)激機(jī)制，從而指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際。目前，在西伯利亞鱘（Acipenser baerii）[10]、青魚（Mylopharyngodon piceus）[11]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[12]及黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[13]等淡水養(yǎng)殖魚類中，已開展氨氮脅迫下免疫毒性機(jī)制等相關(guān)研究，但在鲌亞科魚類中則未見報(bào)道。同時(shí)，肝臟在魚體生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用，可以反映出高氨氮等不利條件下機(jī)體器官的損傷程度[14-15]。超氧化物歧化酶（SOD）作為重要的抗氧化酶，可以清除生物體內(nèi)多余的自由基，SOD活性的提高有助于保護(hù)肝臟免受低氧脅迫的損傷[16-17]。養(yǎng)殖水體中的氨氮損害幼魚抗氧化系統(tǒng)[18]，高濃度氨氮急性脅迫引起仔魚生長遲緩和氧化應(yīng)激[19]，超過了機(jī)體的調(diào)節(jié)能力，機(jī)體清除氧自由基的能力減弱，活性氧大量積累，造成機(jī)體氧化損傷[20]，降低了其抗氧化性能，削弱了其非特異免疫防御機(jī)能[19]，長期處于氨氮脅迫下將不利于幼魚健康生長[21]。同時(shí)，持續(xù)炎癥反應(yīng)及抗氧化系統(tǒng)功能受抑制是氨氮中毒死亡的主要原因[22]。肝胰臟SOD活性能夠準(zhǔn)確反映氧化損傷的程度，可作為有效的生物標(biāo)志物，對氨氮的毒性做出評價(jià)[18]。

本研究采用組織學(xué)和生理生化學(xué)方法，在不同氨氮濃度和脅迫時(shí)間條件下，氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的測定以及肝臟組織損傷的觀察，深入分析翹嘴鲌和翹嘴鲌“全雌1號”在氨氮脅迫下的生理應(yīng)答反應(yīng)及耐受性，有利于深入了解翹嘴鲌“全雌1號”的氨氮抗逆性，為翹嘴鲌“全雌1號”的持續(xù)選育與健康養(yǎng)殖提供依據(jù)，并為全雌魚的研究提供基礎(chǔ)生物學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022年在浙江省淡水水產(chǎn)研究所德清試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)對象為翹嘴鲌及翹嘴“全雌1號”，試驗(yàn)魚魚體規(guī)格為（4.87±0.36）g，其中翹嘴鲌“全雌1號”為浙江省淡水水產(chǎn)研究所牽頭的水產(chǎn)育種協(xié)作組培育，是2020年度全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定通過的14個(gè)國家水產(chǎn)新品種之一。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)前，將試驗(yàn)魚在試驗(yàn)水槽中暫養(yǎng)72 h。試驗(yàn)用水為經(jīng)超濾系統(tǒng)超濾的淡水，用分析純氯化銨試劑（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）調(diào)節(jié)試驗(yàn)組總氨氮濃度。隨機(jī)挑選體色正常、健康活潑、規(guī)格相近的試驗(yàn)魚移入試驗(yàn)水槽中，每個(gè)水槽30尾。試驗(yàn)前停食48 h，整個(gè)試驗(yàn)期間停止投餌。試驗(yàn)水溫（21±1）℃，pH為7.5±0.5，24 h連續(xù)微充氣以保證溶解氧含量7.0 mg/L以上。為保證試驗(yàn)用水氨氮濃度穩(wěn)定，每隔4 h監(jiān)測并調(diào)節(jié)總氨氮濃度，每次換水量不超過20%，并及時(shí)剔除死亡個(gè)體。試驗(yàn)過程中，連續(xù)觀察各組試驗(yàn)魚的活動(dòng)及存活死亡情況，并記錄各時(shí)期的死亡數(shù)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)束后，采用直線內(nèi)插法[23]計(jì)算得出翹嘴鲌和翹嘴鲌“全雌1號”的半致死濃度（96 h LC50）和安全濃度（SC=0.1 × 96 h LC50），分別設(shè)置對照組（0 mg/L）和低濃度組（8 mg/L）、高濃度組（16 mg/L）2個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

氨氮脅迫試驗(yàn)期間，分別于0、6、12、24、48和96 h采集試驗(yàn)魚肝臟，立即放入液氮中，后將樣品轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存。按每克待測樣組織加入9 mL生理鹽水的比例配制組織勻漿液，研磨后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝后放入4 ℃冰箱暫存，用于測定SOD活性。SOD均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。同時(shí)，取高、低濃度氨氮脅迫0、48和96 h試驗(yàn)魚肝臟，保存于波恩氏液（福州飛凈生物科技有限公司）中，后經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)橫切，切片厚度為6 μm，HE染色，顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

采用常規(guī)生物急性毒性試驗(yàn)方法，研究確定氨氮對翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”的96 h LC50。結(jié)果顯示，隨著氨氮濃度的增加，毒性作用增強(qiáng)，翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”的死亡率隨氨氮濃度的增加而增加，詳見表1。同時(shí)，通過直線內(nèi)插法計(jì)算得到氨氮對翹嘴鲌96 h的 LC50和SC分別為23.90 和2.39 mg/L，對翹嘴鲌“全雌1號”96 h的 LC50和SC為25.73和2.57 mg/L。

表1 0～30 mg/L氨氮脅迫96 h翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”死亡率Table 1 0-30 mg/L ammonia nitrogen stress 96 h mortality rate of C.alburnus and C.alburnus var.′All-Female 1′

2.2 氨氮脅迫對翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”死亡率的影響

翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”的死亡率隨氨氮濃度與氨氮脅迫時(shí)間的增加而提高。其中翹嘴鲌8和16 mg/L濃度組的96 h死亡率均顯著高于脅迫24和48 h的死亡率（P<0.05）；翹嘴鲌“全雌1號”16 mg/L濃度組的96 h死亡率均顯著高于脅迫24和48 h的死亡率（P<0.05）。在氨氮濃度為8 mg/L時(shí)，翹嘴鲌“全雌1號”均無死亡，但翹嘴鲌?jiān)?6 h時(shí)有少量死亡；在氨氮濃度為16 mg/L時(shí)，翹嘴鲌“全雌1號”24 h與96 h的死亡率均顯著低于翹嘴鲌（P<0.05）。因此，在氨氮濃度為8和16 mg/L時(shí)，翹嘴鲌“全雌1號”相對翹嘴鲌死亡率更低，詳見表2。

表2 不同氨氮濃度和脅迫時(shí)間翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”24～96 h的死亡率Table 2 The mortality rate of C.alburnus and C.alburnus var.′All-Female 1′ subjected to different ammonia nitrogen concentrations and stress time for 24-96 h %

2.3 氨氮脅迫對肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

組織學(xué)觀察結(jié)果顯示：翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”肝臟病理組織損傷類似。由圖1可見，氨氮脅迫前，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞輪廓清晰。低濃度氨氮脅迫48 h時(shí)，肝細(xì)胞腫脹，并出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞核腫大或偏移。低濃度氨氮脅迫96 h時(shí)，肝細(xì)胞腫脹更加明顯，空泡化更嚴(yán)重，血竇略微擴(kuò)張。高濃度氨氮脅迫48 h時(shí)，細(xì)胞核腫大、偏移或溶解，肝細(xì)胞部分溶解、輪廓模糊，血竇擴(kuò)張。而高濃度氨氮脅迫96 h時(shí)，出現(xiàn)大面積細(xì)胞核腫大，細(xì)胞溶解、輪廓模糊，血竇擴(kuò)張嚴(yán)重?？傊钡{迫使肝臟出現(xiàn)病理學(xué)組織損傷，且損傷隨氨氮濃度及脅迫時(shí)間的增加而逐步增強(qiáng)。

圖1 不同氨氮濃度和脅迫時(shí)間對肝組織學(xué)的影響Figure 1 Effect of ammonia nitrogen stress on liver histology under different ammonia nitrogen concentration and stress time

2.4 氨氮脅迫對體內(nèi)SOD酶活力的影響

翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”SOD酶活性的變化曲線表明，兩種魚對照組的變化均穩(wěn)定在一定值，而高、低濃度組則呈先升高后降低再升高的趨勢，在6 h時(shí)達(dá)最大值后快速下降，至12 h時(shí)下降至最低值，之后緩慢上升，并于96 h時(shí)恢復(fù)至對照組水平，且高濃度組的SOD指標(biāo)均高于低濃度組。同時(shí)，翹嘴鲌“全雌1號”SOD酶活指標(biāo)升高時(shí)幅度更大，活性下降時(shí)幅度更小，在相同氨氮濃度與脅迫時(shí)間下比翹嘴鲌活性更高，詳見圖2和圖3。

圖2 翹嘴鲌各組SOD值變化曲線Figure 2 Change curve of SOD value in each group of C.alburnus

圖3 翹嘴鲌“全雌1號”各組SOD值變化曲線Figure 3 Change curve of SOD value in each group of C.alburnus var.′All-Female 1′

3 討論與結(jié)論

氨氮是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要環(huán)境因子，高水平氨氮可引起魚類氧化應(yīng)激，造成組織氧化損傷[24-26]，嚴(yán)重時(shí)會抑制魚類的生長、危害健康，甚至導(dǎo)致死亡[27-28]。肝臟是魚類重要的解毒和代謝器官，是受水體污染物影響最大的器官之一[29]。氨氮可通過肝門靜脈到達(dá)肝臟，參與肝的代謝反應(yīng)[30]。本試驗(yàn)中，翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”肝臟的組織切片結(jié)果表明，氨氮對肝臟組織結(jié)構(gòu)影響的表現(xiàn)一致，均為從初始的肝細(xì)胞腫脹及出現(xiàn)空泡化至后期的細(xì)胞空泡化嚴(yán)重、細(xì)胞變形、核仁消失、血竇擴(kuò)張。這在其他魚類的氨氮脅迫中也出現(xiàn)類似的結(jié)果，如張武肖等[31]對團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）進(jìn)行氨氮脅迫研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在氨氮脅迫初期主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫大，此后細(xì)胞空泡化逐漸嚴(yán)重，直至出現(xiàn)大批肝細(xì)胞壞死，這與本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，說明肝細(xì)胞隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長損傷也會增加。同時(shí)，張武肖還推測肝臟抗氧化酶的活性與肝臟的組織學(xué)變化具有相關(guān)性。另外，由于細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，說明肝功能可能受到影響，而細(xì)胞壞死的先兆往往是細(xì)胞變形、核仁消失、細(xì)胞核空泡化等[32-33]，而這些現(xiàn)象在本次試驗(yàn)的高氨氮脅迫后期明顯增加。這表明長時(shí)間或者高濃度的氨氮脅迫下，可能由于肝細(xì)胞損傷數(shù)量的增加導(dǎo)致肝臟病理組織損傷更加明顯。

魚類可通過提高抗氧酶活性或抗氧化物水平以增強(qiáng)機(jī)體抗應(yīng)激能力，維持應(yīng)激下機(jī)體正常生理功能[24,27,34-36]。在本次氨氮脅迫試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)高、低氨氮濃度組的抗氧化酶活性變化均呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢。而強(qiáng)俊等[12]認(rèn)為一定氨氮濃度下，機(jī)體通過增加代謝以應(yīng)對環(huán)境脅迫，而氧自由基的量也隨之增加，抗氧化酶活力的增加可以減輕脂質(zhì)過氧化的損傷，是一種生物體對新陳代謝的適應(yīng)。劉洋等[37]認(rèn)為造成抗氧化酶活性首先升高的原因可能是氨氮在脅迫初期對抗氧化酶活性有誘導(dǎo)作用，這種誘導(dǎo)作用是由活性氧自由基的增加所引起的機(jī)體代償性增多所致。而本次試驗(yàn)抗氧化酶SOD活性在氨氮脅迫后期有所回升，這是否說明氨氮脅迫對肝臟產(chǎn)生的毒害作用可逆，需要今后進(jìn)一步探索。同時(shí)，我們比較高、低濃度氨氮對抗氧化酶活性的影響，認(rèn)為低濃度組比高濃度組更有助于抑制氧化自由基的產(chǎn)生，這提示我們在日常養(yǎng)殖生產(chǎn)中，必須密切關(guān)注水體中的氨氮濃度，以免氨氮濃度過高造成魚類的抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，影響?zhàn)B殖成活率。另一方面，由于抗逆性強(qiáng)的品種在逆境中抗氧化酶活性升高時(shí)幅度更大，活性下降時(shí)幅度更小或抗逆性強(qiáng)的品種活性升高而抗逆性弱的品種則活性降低[38]。綜上所述，對比了翹嘴鲌及翹嘴鲌“全雌1號”在氨氮脅迫試驗(yàn)中抗氧化酶的活性變化，發(fā)現(xiàn)翹嘴鲌“全雌1號”在高、低氨氮環(huán)境中抗氧化酶活性高于普通翹嘴鲌，推測翹嘴鲌“全雌1號”相比普通翹嘴鲌，在一定程度上具有更強(qiáng)的氨氮抗逆性，其是不是由新品種選育過程中持續(xù)多代的群體選育、異源雌核發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)的偽雄魚誘導(dǎo)等育種方法起了作用，還有待對其氨氮脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的解析。隨著高密度集約化養(yǎng)殖發(fā)展，氨氮成為限制漁業(yè)發(fā)展的重要因素，然而國內(nèi)尚無針對氨氮耐受培育出的魚類新品種[39]，因此，本研究結(jié)果能為翹嘴鲌新品種的持續(xù)選育與健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。