李歡，安凱，孫長(zhǎng)花，孫紅艷

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州市農(nóng)產(chǎn)品智能測(cè)控與清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江陰市富仁高科股份有限公司南京分公司，南京 210012；4.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

近年來(lái)研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)circRNA并非轉(zhuǎn)錄噪聲，而是一種新型的、幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力的非編碼RNA，可在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[1]。其特點(diǎn)是在RNA發(fā)生剪切后，外顯子5′端的受體剪接位點(diǎn)和下游外顯子3′端的供體位點(diǎn)連接，形成共價(jià)閉環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，不易被RNA酶降解[2]。目前多項(xiàng)研究表明circRNA在家禽生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖以及疾病中均發(fā)揮著重要作用[3-4]。例如，Yu H.L.等發(fā)現(xiàn)circRNA4338能夠協(xié)同VPREB3和CXCL13L3參與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）感染過(guò)程中的免疫反應(yīng)[3]。Chen L.等的研究表明過(guò)表達(dá)或敲低circ_EZH2分別顯著性抑制或促進(jìn)新城疫病毒（Newcastle disease virus）的復(fù)制，參與免疫應(yīng)答過(guò)程[4]。

我們前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)在傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica serovar Typhymurium）衍生的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）感染前后circ_DNAJC3的表達(dá)量極顯著性降低，表明此circRNA在細(xì)菌感染中可能發(fā)揮重要的作用。環(huán)狀circ_DNAJC3的源基因?yàn)镈NAJC3，位于雞1號(hào)染色體上。DNAJC3是DNAJ熱休克蛋白家族（Hsp40）的成員，參與蛋白質(zhì)的折疊和組裝；并可作為分子伴侶激活HSP70的ATPase活性[5]。Kuo Y.等發(fā)現(xiàn)DnaJ具有抑制果蠅中錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的聚集和毒性[6]。J.Hageman等證明DnaJs在非洲爪蟾中可以保護(hù)細(xì)胞免受由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)毒性引起的損傷[7]。此外，DNAJC3也參與細(xì)胞凋亡，降解損失蛋白，對(duì)細(xì)胞生存至關(guān)重要。

巨噬細(xì)胞是家禽重要的免疫細(xì)胞，是抵御各種細(xì)菌感染的第一道防線。在畜牧獸醫(yī)研究領(lǐng)域，雞巨噬細(xì)胞HD11是一種永生細(xì)胞系，廣泛應(yīng)用于病原微生物、宿主免疫以及微生物與宿主相互作用機(jī)制的研究。本研究以雞巨噬細(xì)胞HD11為研究材料，通過(guò)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、Sanger測(cè)序、亞細(xì)胞定位、RT-qPCR以及生物信息學(xué)軟件鑒定circ_DNAJC3是否存在、解析其在細(xì)胞中的位置和在各組織中的表達(dá)水平，并預(yù)測(cè)其功能和潛在作用方式，為進(jìn)一步研究circ_DNAJC3在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程（特別是細(xì)菌感染過(guò)程）中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞巨噬細(xì)胞HD11來(lái)自于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物遺傳實(shí)驗(yàn)室。Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies；TIANamp基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京天根生物試劑公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR PrimeScript PLUS RTRNA PCR Kit購(gòu)自中國(guó)大連的Takara；RNase R購(gòu)自瑞典的Epicenter公司；RT-qPCR定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit購(gòu)自中國(guó)大連的Takara；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)的Bio-Rad；PBS和DMEM購(gòu)自美國(guó)的Hyclone；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)的GIBICO。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)雞DNAJC3基因（基因ID: 418787）和雞circ_DNAJC3的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)circ_DNAJC3的發(fā)散型引物和DNAJC3的收斂型引物。引物序列見(jiàn)表1。

表1 環(huán)狀RNA和基因的引物序列Table 1 Primer sequence for circRNAs and genes

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

雞巨噬細(xì)胞在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，濕度為60%～70%，二氧化碳濃度為5%。

1.2.3 總RNA和基因組DNA的提取和質(zhì)量控制

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，收集雞巨噬細(xì)胞。利用TRIzol試劑盒提取巨噬細(xì)胞的總RNA。利用基因組DNA試劑盒提取基因組DNA（gDNA）。利用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)分別檢測(cè)提取的RNA或DNA的質(zhì)量和濃度。A260/280比值大于2代表RNA質(zhì)量合格。A260/280的比值在1.8時(shí)代表DNA質(zhì)量合格。

1.2.4 雞circ_DNAJC3環(huán)狀結(jié)構(gòu)的檢測(cè)

將1.2.3中獲得的質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板，利用circ_DNAJC3的發(fā)散型和DNAJC3的收斂型引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。同時(shí)，以1.2.3中獲得的質(zhì)量合格的基因組DNA（gDNA）為模板，利用circ_DNAJC3的發(fā)散型和DNAJC3收斂型引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。將獲得的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定circ_DNAJC3的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

1.2.5 RNase R消化

在37 ℃下，利用3 U/μg RNase R消化1.2.3中獲得的質(zhì)量合格的總RNA（2 μg）30 min。隨后，將總RNA置于70 ℃下繼續(xù)消化10 min。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNase R處理前后的總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA。并以此為模板，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)，檢測(cè)circ_DNAJC3和其源基因DNAJC3的表達(dá)水平。同時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工（中國(guó)上海）進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)

根據(jù)NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，分離雞巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。利用TRIzol試劑盒分別從細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中提取其總RNA。對(duì)分離的總RNA進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)以分別檢測(cè)circ_DNAJC3在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平。RT-qPCR試驗(yàn)具體步驟見(jiàn)1.2.8。

1.2.7 不同組織的總RNA的提取

采集6只成年三黃雞（公雞）的心臟、十二指腸、脾臟、腿肌、大腦、小腦、回腸、肺臟、胃臟、下丘腦、哈德氏腺、肝臟、胸腺及盲腸組織后保存于液氮中。利用TRIzol試劑盒分別提取上述不同組織的總RNA?？俁NA的質(zhì)量檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)同1.2.3。將質(zhì)量合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板開(kāi)展RT-qPCR試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)circ_DNAJC3在不同組織中的表達(dá)水平。RT-qPCR試驗(yàn)具體步驟見(jiàn)1.2.8。

1.2.8 RT-qPCR試驗(yàn)

來(lái)自1.2.5、1.2.6和1.2.7中質(zhì)量合格的總RNA分別通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR PrimeScript PLUS RTRNA PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)。RT-qPCR試驗(yàn)的循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；40個(gè)循環(huán)。選擇GAPDH基因作為內(nèi)參基因。使用2-ΔΔCt方法對(duì)RTqPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)樣本有3個(gè)單獨(dú)的重復(fù)。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）來(lái)檢測(cè)circ_DNAJC3是否具有開(kāi)放閱讀框（ORF）及編碼潛能。利用RNAfold WebServer（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWeb-Suite/RNAfold.cgi）預(yù)測(cè)circ_DNAJC3的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用circAtlas（https://ngdc.cncb.ac.cn/circatlas/）預(yù)測(cè)circ_DNAJC3的RNA結(jié)合蛋白。利用軟件miRanda（http://cbio.mskcc.org/microrna_data/miRandaaug2010.tar.gz）來(lái)預(yù)測(cè)circ_DNAJC3可能互作的miRNAs，以及這些預(yù)測(cè)的miRNAs的靶基因。進(jìn)一步用在線軟件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析并進(jìn)行多重比較。使用JMP統(tǒng)計(jì)軟件（Version 15.2.1, SAS Institute）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 雞circ_DNAJC3環(huán)狀結(jié)構(gòu)的鑒定

前期我們對(duì)LPS感染前后的雞肺臟進(jìn)行RNAseq，結(jié)果顯示circ_DNAJC3的表達(dá)水平顯著性降低（圖1A）。Circ_DNAJC3來(lái)源于1號(hào)染色體上雞DnaJ熱休克蛋白家族（Hsp40）成員C3（DNAJC3）基因的外顯子2至4（圖1B）。為了檢測(cè)circ_DNAJC3是否具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，我們根據(jù)其序列構(gòu)建了一對(duì)發(fā)散型（背靠背設(shè)計(jì)circ_DNAJC3的引物）和收斂型（正常設(shè)計(jì)DNAJC3的引物）引物。結(jié)果顯示以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，circ_DNAJC3和其源基因DNAJC3以及GAPDH的引物均能擴(kuò)增出條帶；而circ_GAPDH的引物不能擴(kuò)增出條帶（圖2A）。以gDNA為模板時(shí)，circ_DNAJC3和circ_GAPDH的引物均不能擴(kuò)增出條帶，而源基因DNAJC3和GAPDH的引物可以擴(kuò)增出條帶（圖2B）。以上結(jié)果表明circ_DNAJC3存在環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖1 雞circ_DNAJC3的基本信息Figure 1 The basic information of chicken circ_DNAJC3

圖2 雞circ_DNAJC3的鑒定Figure 2 Identification of chicken circ_DNAJC3

3.2 雞circ_DNAJC3的穩(wěn)定性檢測(cè)

為進(jìn)一步驗(yàn)證circ_DNAJC3的穩(wěn)定性，我們利用RT-qPCR來(lái)檢測(cè)以RNase R處理前后的總RNA為模板時(shí)circ_DNAJC3和DNAJC3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示circ_DNAJC3的表達(dá)水平在RNase R處理前后無(wú)顯著性差異（圖3A）。而其源基因DNAJC3的表達(dá)水平在RNase R消化后發(fā)生顯著性下降（圖3A）。同時(shí)，Sanger測(cè)序結(jié)果顯示circ_DNAJC3的產(chǎn)物序列正確，存在環(huán)化位點(diǎn)GG（圖3B）。以上結(jié)果表明circ_DNAJC3具有穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖3 雞circ_DNAJC3的穩(wěn)定性檢測(cè)Figure 3 The stability identification of chicken circ_DNAJC3

3.3 雞circ_DNAJC3的亞細(xì)胞定位

利用NE-PER試劑盒分離雞巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)后，提取相應(yīng)的總RNA用于后續(xù)RTqPCR試驗(yàn)以檢測(cè)circ_DNAJC3在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示雞circ_DNAJC3在細(xì)胞質(zhì)中顯著性富集（圖4）。

圖4 雞circ_DNAJC3的亞細(xì)胞定位Figure 4 Subcellular localization of chicken circ_DNAJC3

圖5 Circ_DNAJC3的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure 5 Prediction of the secondary structure of circ_DNAJC3

3.4 Circ_DNAJC3的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

RNA結(jié)構(gòu)的確定對(duì)于理解其功能、結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系以及設(shè)計(jì)靶向RNA的治療和診斷非常重要。自由能最小化是闡明RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要工具，它可以幫助確定比較序列分析模型，或者建議通過(guò)定點(diǎn)誘變或其他方法測(cè)試可能的結(jié)構(gòu)。因此，我們利用在線分析軟件RNAfold WebServer預(yù)測(cè)了circ_DNAJC3二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能。結(jié)果顯示circ_DNAJC3二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能為-67.00 kcal/mol。RNA分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是由于堿基配對(duì)造成了能量的降低。因此，circ_DNAJC3的自由能顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

3.5 Circ_DNAJC3在不同物種中的保守性檢測(cè)

為確定circ_DNAJC3在不同物種中是否廣泛存在及其保守性，我們分別比對(duì)了circ_DNAJC3在人（Has，human）、大鼠（Rno，rat）、小鼠（Mmu，mouse）、豬（Ssc，pig）、牛（Bta，cattle）和雞（Gga, chicken）中的同源性。結(jié)果顯示circ_DNAJC3在上述6個(gè)物種中的序列長(zhǎng)度為236～311 bp（表2）。其中人circ_DNAJC3的序列與雞的同源性最高，為80.39%；而豬circ_DNAJC3的序列與雞的同源性最低，為58.84%（表2）。

表2 不同物種的circ_DNAJC3序列信息Table 2 The information of circ_DNAJC3 sequence of different species

3.6 Circ_DNAJC3互作RNA結(jié)合蛋白（RBP）的預(yù)測(cè)

RBP是一類通過(guò)介導(dǎo)RNA成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯，與RNA代謝過(guò)程相關(guān)的蛋白質(zhì)。RBP在circRNA的生命周期中起著不可或缺的作用，二者的互作是雙向的，即RBP可以調(diào)控circRNA，circRNA也可以調(diào)節(jié)RBP。因此，我們對(duì)circ_DNAJC3互作的RBP進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示AGO2和circ_DNAJC3的結(jié)合位點(diǎn)最多（N=287），其次為CELF2、PTBP1和HNRNPC（表3）。

表3 Circ_DNAJC3互作RNA結(jié)合蛋白（RBP）的預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of circ_DNAJC3 interacting with RNA Binding Protein (RBP)

3.7 雞circ_DNAJC3在不同組織中的表達(dá)譜

為檢測(cè)雞circ_DNAJC3在不同組織中的表達(dá)規(guī)律，我們采集心臟、十二指腸、脾臟、腿肌、大腦、小腦、回腸、肺臟、胃臟、下丘腦、哈德氏腺、肝臟、胸腺及盲腸組織，提取其總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為RT-qPCR試驗(yàn)的模板。結(jié)果顯示以circ_DNAJC3在心臟中的表達(dá)為基準(zhǔn)時(shí)，circ_DNAJC3在回腸、胸腺、脾臟、盲腸、胃臟、肺臟、肝臟和哈德林腺體中具有較高的表達(dá)量（P<0.01）；而其在下丘腦、大腦、小腦和十二指腸中表達(dá)量較低（圖6）。

圖6 雞circ_DNAJC3在不同組織中的表達(dá)規(guī)律Figure 6 The expression pattern of circ_DNAJC3 in chicken different tissues

3.8 Circ_DNAJC3的編碼潛力

Circ_DNAJC3是一種保守的環(huán)狀RNA，來(lái)源于其源基因DNAJC3的外顯子2至4形成共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。我們通過(guò)ORFfinder網(wǎng)站檢測(cè)不同物種的circ_DNAJC3開(kāi)放閱讀框（ORF）來(lái)預(yù)測(cè)其編碼潛能。如表4所示，雞circ_DNAJC3的ORF起始于45 bp，終止于311 bp，其長(zhǎng)度為267 bp；其可能編碼的氨基酸（aa）長(zhǎng)度為88。在豬中，我們預(yù)測(cè)circ_DNAJC3不具有編碼潛力。在人、大鼠、小鼠和牛中，circ_DNAJC3可能具有編碼能力，其編碼的aa的同源性與雞比偏低（<50%）。以上預(yù)測(cè)結(jié)果表明雞、人、大鼠、小鼠和牛中，circ_DNAJC3可能具有編碼潛力。

表4 不同物種中circ_DNAJC3的開(kāi)放閱讀框（ORF）信息Table 4 The open reading frame (ORF) information of circ_DNAJC3

3.9 構(gòu)建circ_DNAJC3-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步解析雞circDNAJC3的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們利用miRanda來(lái)預(yù)測(cè)可能與circ_DNAJC3相互作用的miRNA和mRNA。結(jié)果顯示，雞circ_DNAJC3環(huán)狀結(jié)構(gòu)可結(jié)合已知miRNA，gga-miR-132b-5p。同時(shí)，我們預(yù)測(cè)gga-miR-132b-5p可能有33個(gè)靶基因（圖7）。KEGG結(jié)果顯示這些靶基因在鈣離子信號(hào)通路（calcium signaling pathway）中顯著性富集。

圖7 與circDNAJC3相互作用的gga-miR-132b-5p及其可能的靶基因Figure 7 The potential target genes of gga-miR-132b-5p that can interact with circDNAJC3

4 討論

雞巨噬細(xì)胞的免疫過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的生物過(guò)程，不僅受到遺傳因素的影響，還受到表觀遺傳修飾的作用[8-10]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白乙?；约胺蔷幋aRNA等。目前，在人類（Homo sapiens）、小鼠（Mus muculus）和豬（Sus scrofa）等物種的各種免疫組織或細(xì)胞中已經(jīng)鑒定出許多circRNAs[11-13]。例如，Zhu X.Y.等發(fā)現(xiàn)circHIPK3能夠參與T細(xì)胞活化和增殖的調(diào)節(jié)[14]。我們前期的RNAseq試驗(yàn)顯示circ_DNAJC3在LPS感染前后表達(dá)水平顯著性降低。因此，本研究我們旨在進(jìn)一步鑒定circ_DNAJC3是否真實(shí)存在，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析其潛在作用機(jī)制。

大量研究結(jié)果顯示多數(shù)circRNAs主要由外顯子反向剪接組成共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在物種間具有保守性，比線性RNA更穩(wěn)定，其表達(dá)在組織和發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出特異性[15-17]。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序以及RNase R消化確定雞circ_DNAJC3存在穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)，除了豬之外，circ_DNAJC3在其他物種中相對(duì)比較保守。Zhang X.M.等在蜜蜂中發(fā)現(xiàn)DNAJC3在肌肉和表皮中高表達(dá)[18]。本研究顯示circ_DNAJC3在回腸、胸腺、脾臟、盲腸、胃臟、肺臟、肝臟和哈德林腺體中高表達(dá)，表明此circRNA可能在免疫組織中發(fā)揮重要作用。亞細(xì)胞定位顯示雞circ_DNAJC3位于細(xì)胞質(zhì)中，可能與源基因DNAJC3有相似的功能。

近來(lái)越來(lái)越多的研究表明circRNA可作為分子海綿競(jìng)爭(zhēng)性吸附miRNA，進(jìn)而參與免疫反應(yīng)[19-21]。例如，circ_DCLRE1C能夠調(diào)節(jié)雞巨噬細(xì)胞中的miR-214b-3p/STAT3通路，以進(jìn)一步調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[22]。本研究顯示雞circ_DNAJC3可能與gga-miR-132b-5p發(fā)生相互作用。我們預(yù)測(cè)gga-miR-132b-5p的靶基因在鈣離子信號(hào)通路（calcium signaling pathway）中顯著性富集，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝。

5 結(jié)論

本研究顯示在雞巨噬細(xì)胞中，circ_DNAJC3主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，是一種穩(wěn)定、保守的環(huán)狀RNA，主要在回腸、胸腺、脾臟、盲腸、胃臟、肺臟、肝臟和哈德氏腺中高表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)雞circ_DNAJC3可能互作的RNA結(jié)合蛋白為AGO2、CELF2、PTBP1和HNRNPC；并可能與ggamiR-132b-5p發(fā)生相互作用，進(jìn)而通過(guò)鈣離子信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝。