李佳瑩，宮樹森，秦英，金璨，吳田

（西南林業(yè)大學園林園藝學院，昆明 650224）

海巴戟（Morinda citrifoliaL.）別名諾麗，為茜草科（Rubiaceae）巴戟天屬的多年生熱帶、亞熱帶植物，海巴戟果實具有可食用性，含有豐富的功能性成分和營養(yǎng)成分，被廣泛應用于醫(yī)學、食品等領域[1]。海巴戟果實成熟類型為呼吸躍變型，在成熟階段中體積逐漸膨大，表皮由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槟贪咨镔|(zhì)積累逐步達到鼎盛狀態(tài)，而果實硬度則呈現(xiàn)下降狀態(tài)。有研究表明，果實硬度與果實組織細胞的細胞壁等細胞結(jié)構(gòu)有密切的聯(lián)系[2]。細胞壁作為植物所特有的一種細胞結(jié)構(gòu)，對細胞起著保護和支撐的作用。XTH作為細胞壁松弛因子[3]，通過對半纖維素木葡聚糖有轉(zhuǎn)糖基和水解作用，從而修飾細胞壁功能，在果實成熟的過程中起到軟化果實的作用[4]。因此，XTH基因在海巴戟果實軟化過程中的功能研究具有重要的意義。通過M.J.Baumann等[5]對XTH活性蛋白的研究，發(fā)現(xiàn)按照XTH蛋白可以被分為兩類。一類具有木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶活性（xyloglucan endoglycosylase, XET），對木葡聚糖分子進行內(nèi)切，并將內(nèi)切產(chǎn)生的還原性末端連接到另外一個木葡聚糖鏈上；另一類具有木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖水解酶（xyloglucan endo-hydrolase, XEH）活性，對木葡聚糖β-1,4糖苷鍵具有專一性水解作用[6]。XTH是一類多基因家族的編碼蛋白[7]，在與最適底物木葡聚糖相結(jié)合后，能使底物水解并產(chǎn)生中間產(chǎn)物“糖基-酶”，繼而進一步產(chǎn)生糖基酶反應和水解反應，從而作用在細胞壁結(jié)構(gòu)上，調(diào)節(jié)細胞壁的完整性[8]，其中序列為DEIDFEFLG的催化位點起重要作用，與XTH的酶促反應相關(guān)，是XTH基因家族的一段保守基因序列[9-10]。通常XTH基因家族有20～60個成員在同類高等植物基因組中[11]。已公布的基因組數(shù)據(jù)顯示，從花[12]、莖干[13]、根系[14]和果實[15]等不同部位在生長發(fā)育過程中受到各種環(huán)境刺激，會影響XTH的活性和XTH基因的表達情況。張萍萍等[12]對大麗花（Dahlia pinnatacv.Danbanhuang）進行高溫脅迫處理，顯著性抑制DpXTH1和DpXTH2的表達；C.F.Nardi等[15]對草莓（Fragaria×ananassaDuch.）XTH基因家族中3個不同品種的果實進行赤霉素和脫落酸處理，發(fā)現(xiàn)FaXTH1對果實有軟化作用；對在常溫貯藏過程中的桃（Prunus persica）果實進行XTH基因家族的基熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測，PpXTH33在溶質(zhì)桃與硬質(zhì)桃2種不同硬度果實中特異性表達，與果實軟化密切相關(guān)[16]；對在成熟發(fā)育過程中的棗（Ziziphus jujuba）果實利用熒光定量PCR檢測XTH基因表達量，分析表明軟化階段比生長階段XTH基因更為活躍[17]。

近年來，隨著對果實成熟軟化的深入研究，研究者們開始關(guān)注XTH基因在果實軟化過程中的作用。果實采摘前為成熟階段，采摘后為后熟階段，有研究表明，獼猴桃（Actinidia deliciosa）XTH基因家族中的AdXTH5、AdXTH7基因分別在成熟階段和后熟階段大量表達，釋放大量內(nèi)源乙烯，使果實快速軟化[18]。對葡萄（Vitis vinifera）進行外源乙烯利處理，可以刺激XTH基因表達導致果實膨脹變大[19]。對丙烯處理后的柿（Diospyros kaki）果實構(gòu)建XTH基因家族原核重組蛋白，部分重組蛋白表現(xiàn)出XET活性，推測有XTH基因參與細胞壁重組及組裝[20]。這些研究表明植物激素乙烯是果實軟化的重要影響因子[21]，在呼吸躍變型果實的成熟過程中，可以通過增加果實對乙烯的接受能力，包括內(nèi)源乙烯的釋放及外源乙烯的處理，促進果實軟化，通過調(diào)控XTH基因?qū)χ参锛毎诘乃夂椭貥?gòu)，在果實的成熟和軟化過程中起到一定的催化作用。

本研究通過乙烯對后熟階段海巴戟果實產(chǎn)生的影響，揭示海巴戟果實的軟化規(guī)律，并通過果實采后0～48 h轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果找到對果實軟化起重要作用的基因XTH。通過對XTH基因進行克隆和表達分析，以期后續(xù)研究成果可以在海巴戟果實采后儲存運輸?shù)确矫嫣峁┍憷瑸楸ＷC果實品質(zhì)添加一層保障。測量成熟階段不同成熟度海巴戟果實硬度，并對海巴戟XTH基因進行克隆和表達分析，為進一步明確其功能，揭示海巴戟果實軟化機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料中海巴戟果實均為2019年7月于云南省元江縣的海巴戟種植基地（102°E, 23.59°N）采摘。元江為季風氣候，立體氣候特點分明，陽光充足、雨熱同季且年均溫約為23～25 ℃，年均降水量1 600 mm，全年無霜，是符合海巴戟生長的自然環(huán)境條件。

對后熟階段的果實標記分裝后進行保鮮處理備用，以果實成熟過程中色澤變化及果實大小為判斷依據(jù)，綠色小果為未成熟狀態(tài)，對成熟階段的果實按成熟度分為40%（整花脫落）、50%（幼果形成）、60%（幼果膨大）、80%（果實表皮綠色變淺）、100%（果實表皮接近奶白色）成熟[22]，部分保鮮處理，部分切成薄片標記分裝，用液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2 后熟階段的果實硬度檢測

對后熟階段保鮮狀況良好的海巴戟果實分為自然放置組和乙烯利處理組，均置于相對濕度為70%的含有自然光照密閉環(huán)境。自然放置組與乙烯處理組在處理上僅區(qū)別于自然放置組不設處理，而乙烯利處理組在距離果實約5 cm處使用200 mg/L的乙烯利溶液噴施果實至少3次，并以乙烯利溶液濕潤果實表面且能成滴落下為標準。對2組果實每隔8 h按照使用說明使用果實硬度計（GY-2，杭州）測量果實硬度，測量過程中取樣點隨機分布，并設置3個相同成熟度的果實為1組材料，測量4個生物學重復數(shù)據(jù)。

1.3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的目的基因序列分析

基于本課題組前期海巴戟果實采摘后0～48 h轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[23]，以關(guān)鍵詞“XET”“XEH”“XTH”檢索目的基因XTH，并使用NCBI-Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比對，以明確是否存在拼接重疊、兩者是否屬于同類基因且是否具有完整的開放閱讀框（ORF）。

1.4 XTH基因克隆

將上述比對獲得的XTH基因片段根據(jù)XTH基因家族特定的保守結(jié)構(gòu)域的完整性篩選出XTH（DN16278）為目的基因McXTH，使用引物設計軟件Premier 5.0設計特異性引物（表1）。采用Trigol總RNA提取試劑盒（鼎國生物科技有限公司，北京）提取不同成熟度海巴戟果實的RNA，并以其反轉(zhuǎn)錄得到的海巴戟cDNA的一條鏈為模板克隆McXTH基因。對特異性引物進行PCR全長擴增，設置25 μL的反應體系為2× master mix酶12 μL、ddH2O 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL，反應條件為設置94 ℃預變性3 min、94 ℃變性30 s、60 ℃復性30 s、72 ℃延伸30 s和72 ℃重復溫度10 min，共35個循環(huán)。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）回收凝膠，連接pMD18-T Vector克隆載體（TaKaRa公司，大連）轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行涂板，選取生長狀況良好的單菌落進行挑菌，搖菌結(jié)果經(jīng)PCR擴增驗證后，將檢測為陽性的菌液進行測序，菌液PCR的25 μL反應體系除菌液作為反應底物其余同全長擴增體系一致。將測序得到的基因序列與測序獲得的序列進行比對，堿基差異小于5個則視為克隆的序列為目的基因序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 生物信息學分析

將測序得到的目的基因序列，在NCBI-Blast比對，選取相似性較高的氨基酸序列，通過MEGA 7.0軟件分析基因相似性并預測、分析其同源性，并使用TBtools 1.0軟件總結(jié)并建立基于結(jié)構(gòu)域分析的系統(tǒng)進化樹。運用生物信息學在線的蛋白質(zhì)同源建模軟件Swiss-Model Workspace（http://swissmodel.espasy.org/）預測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.6 XTH基因表達量分析

根據(jù)克隆得到的XTH基因序列，使用引物設計軟件Premier 5.0設計XTH基因熒光定量擴增片段引物，參照吳田等以海巴戟Actin基因片段為內(nèi)參基因設計引物[24]（表1），并以不同成熟度的海巴戟果實的cDNA為模板，進行RT-qPCR擴增。RT-qPCR反應體系為20 μL，熒光定量酶10 μL、ddH2O 6.8 μL、不同成熟度果實cDNA單鏈2 μL、正向引物0.6 μL、反向引物0.6 μL，反應程序共40個循環(huán)分為95 ℃預變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 min和72 ℃延伸30 s共4個過程。

1.7 乙烯釋放量檢測

使用便攜式乙烯氣體分析儀（CI-900，美國），按照使用方法說明，按照每3個相同成熟度的海巴戟果實為1組材料的標準，設置3個生物學重復，測量1.1中不同成熟度的海巴戟果實乙烯釋放量。

2 結(jié)果與分析

2.1 后熟階段的海巴戟果實成熟軟化規(guī)律

海巴戟果實的硬度測量結(jié)果顯示，在果實后熟階段的成熟進程中，隨著時間的推移，大概可分為3個階段：快速軟化階段、軟化階段、穩(wěn)定階段，時間大致可對應為0～16 h、16～40 h、40 h以上（圖1），其中在2種處理下0～16 h和16～40 h 2段時間內(nèi)果實硬度變化較大，以0 h、16 h、40 h的果實硬度為時間節(jié)點通過計算3個階段的擬合直線方程得到果實硬度變化斜率（表2）。在0～16 h的過程中外源乙烯利的刺激導致果實更快的軟化，經(jīng)歷相同的時間，經(jīng)過外源乙烯利處理的果實更早地降低了硬度，相較于自然放置的果實，軟化階段更易于過渡到穩(wěn)定階段。也就是說，在海巴戟果實后熟階段，果實對外源乙烯利的刺激有明顯反應，可以推測海巴戟對乙烯敏感，在果實后熟階段通過增加外源乙烯的用量可以加速海巴戟果實的軟化并促進其成熟。

圖1 后熟階段海巴戟果實硬度Figure 1 Firmness of M.citrifolia fruit at post-ripening stage

表2 后熟階段海巴戟果實硬度變化擬合直線方程Table 2 Imitative straight line equation in changs of firmness of M.citrifolia fruit at post-ripening stage

2.2 基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的XTH基因序列分析

對海巴戟果實采摘后0～48 h的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行篩選，檢索出5個基因片段，繪制出對應的基因表達量熱圖（圖2）。經(jīng)過Blast比對結(jié)果顯示基因片段均具有XTH基因家族特有的保守催化位點和GH16結(jié)構(gòu)域，判斷為XTH基因家族基因。根據(jù)熱圖結(jié)果直觀顯示，5個基因片段的表達量中，下調(diào)的3個基因片段中基因片段XTH（DN28281）、XTH（DN2044）在生物學重復中出現(xiàn)零表達，而XTH（DN16391）同上調(diào)基因XTH（DN17930g1）長度不超過400 bp且無完整的開放閱讀框，故選用上調(diào)基因、表達差異極大且有完整開放閱讀框的XTH（DN16278g1）用以進行后續(xù)基因克隆。

圖2 從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到的XTH基因表達量熱圖Figure 2 Heat map of XTH genes expression from the data of transcriptome

2.3 海巴戟XTH基因的克隆及生物信息學分析

使用ORF Finder對克隆出來的XTH基因進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因的完整ORF長度為1 062 bp，與擴增結(jié)果一致（圖3）且編碼353個氨基酸，在127～918 bp的位置包含GH16基因家族，是XTH基因家族獨特的結(jié)構(gòu)域，初步證明該基因是XTH基因家族的一員。

圖3 XTH（DN16278g1）基因的PCR擴增產(chǎn)物Figure 3 PCR amplification product of XTH（DN16278g1）

通過NCBI-Blast比對結(jié)果顯示海巴戟XTH基因編碼的氨基酸序列與其他植物有較大的相似性，選取相似性較大的植物，結(jié)合DNA-man軟件進行序列分析（圖4），采用最大似然法（maximum likelihood method, ML）建立基于結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)進化樹（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海巴戟XTH是XTH家族成員中關(guān)系較遠的一支，且整個基因家族在進化過程中保留較為保守的基因模式。海巴戟與茄科、木犀科、紫葳科、芝麻科植物為親緣關(guān)系較近的一支，在與柿科、豆科等植物為親緣關(guān)系較遠的一支。通過上述比對后，將該基因命名為McXTH，并提交Genbank，獲得登錄號為ON512442。

圖4 海巴戟與其他植物XTH蛋白的氨基酸序列比對Figure 4 Amino acid sequence alignment of M.citrifolia with other XTH proteins

圖5 基于保守結(jié)構(gòu)域的海巴戟XTH與其他植物XTH的系統(tǒng)進化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of XTH from M.citrifolia and other plants based on the conserved domain

對McXTH蛋白進行三級結(jié)構(gòu)進行在線預測（圖6），對比了43個XTH蛋白結(jié)構(gòu)及模型，與數(shù)據(jù)庫目標蛋白木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基化酶1un1.2.A的天然結(jié)構(gòu)相似度達到40%，GMQE值為0.6。通過該結(jié)果可以認為McXTH的蛋白結(jié)構(gòu)同時與木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶、木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖水解酶的結(jié)構(gòu)相關(guān)，具備XTH家族中的典型結(jié)構(gòu)特征。

圖6 McXTH蛋白的三級結(jié)構(gòu)Figure 6 The tertiary structure of McXTH

2.4 McXTH基因的表達分析

分別對成熟度為40%、50%、60%、80%和100%的海巴戟果實中McXTH基因的表達量進行RT-qPCR分析，設置成熟度為40%的海巴戟果實中的McXTH表達量為對照，發(fā)現(xiàn)McXTH在成熟階段皆有表達，并且其表達量隨著果實成熟度增加而上升，在果實成熟度為100%時達到最高值（圖7-A）。

圖7 不同成熟階段的海巴戟果實中McXTH的表達及乙烯釋放量Figure 7 The expression trendency of McXTH and ethylene in different maturity of M.citrifolia fruit

測量不同成熟度的海巴戟果實乙烯釋放量的結(jié)果顯示在不同成熟度的海巴戟果實釋放出的內(nèi)源乙烯差異顯著。隨著海巴戟果實成熟度的提高，海巴戟內(nèi)源乙烯的釋放量相應提高（圖7-B），并在果實成熟度為60%～80%的區(qū)間出現(xiàn)跨越式增長，約為1.7倍。乙烯釋放量與McXTH表達量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢（圖7），因此推測伴隨海巴戟果實成熟，在成熟階段中McXTH基因的表達量與內(nèi)源乙烯釋放量為正相關(guān)關(guān)系，McXTH高表達時，內(nèi)源乙烯釋放量相應較多，作用于海巴戟果實上表現(xiàn)為果實變軟成熟。

3 討論

海巴戟是一種新興的藥食同源植物，富含多種黃酮類、萜類等化合物，其果實等可食用，根、葉、果實等部位均可入藥[25]。本研究用乙烯利處理成熟的海巴戟果實，探究其軟化規(guī)律，并以海巴戟果實cDNA為模板，克隆出McXTH基因。通過RT-qPCR驗證基因表達量，分析了McXTH在不同成熟度海巴戟果實中的表達，并測量同期果實的乙烯釋放量佐證McXTH對海巴戟果實軟化的影響。通過研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，McXTH隨著海巴戟果實的成熟，其表達量不斷上升，當果實趨于成熟時，表達量達到高峰并逐漸趨于平穩(wěn)。

基因表達分析發(fā)現(xiàn)，XTH基因在海巴戟果實成熟過程中受乙烯含量影響軟化程度，其中，成熟階段中McXTH表達量高則內(nèi)源乙烯釋放量高，后熟階段中外援乙烯利處理加速果實軟化。Zhai Z.F.等[26]以甜櫻桃（Prunus aviumL.cv.Zaodaguo）為材料，利用乙烯利進行分組定量處理果實，結(jié)果表示乙烯利的處理使PavXTH15表達上調(diào)，對PavXTH15用櫻桃果實構(gòu)建過表達載體進行瞬時轉(zhuǎn)化，并用RT-qPCR驗證了PavXTH15對果實軟化有顯著的調(diào)控作用，與我們的實驗結(jié)果基本一致。在以往的研究中表明，XTH基因與果實的成熟軟化聯(lián)系密切。辣椒（Capsicum annuumL.）基因組中XTH基因在不同組織中呈現(xiàn)出不同的時空特性，在果實中表現(xiàn)為隨著果實從綠熟期至紅熟期的轉(zhuǎn)變，調(diào)控著果實的膨大[27]，成為果實成熟的重要環(huán)節(jié)。果實作為海巴戟的重要組成部分，軟化是成熟的重要標志，與果肉組織細胞中細胞壁的重構(gòu)有緊密聯(lián)系。木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶是促使細胞壁松弛的重要因子，在果實成熟早期，通過對半纖維素木葡聚糖有轉(zhuǎn)糖基和水解作用來修飾細胞壁的功能，增大細胞壁空隙并促進水解酶釋放，是植物細胞壁重構(gòu)的關(guān)鍵酶。甜瓜（Cucumis meloL.cv Hetao）Cm XTH28-2基因啟動子中含有乙烯應答元件，與調(diào)控細胞壁的作用相呼應，對該基因進行編輯后培育出的過表達果實出現(xiàn)的早熟表型與表達量檢測更是說明其參與調(diào)控果實的成熟進程[28]。Zhang Z.Y.等[29]對早熟蘋果（Malus pumilacv.Taishanzaoxia）XTH基因進行研究，通過對蘋果硬度、乙烯濃度的測定，發(fā)現(xiàn)果實的正常成熟需要乙烯正向調(diào)控XTH基因的活性，同時XTH基因可以作為信號開關(guān)，促進乙烯的釋放并開啟果實成熟軟化的進程。

4 結(jié)論

本研究通過對后熟階段的海巴戟果實軟化推測成熟規(guī)律，并從采摘后0～48 h轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選并克隆海巴戟McXTH基因，通過成熟期不同成熟度的海巴戟果實McXTH基因的表達與乙烯釋放量正相關(guān)的情況，判斷乙烯是促進海巴戟果實成熟軟化的重要因子，后熟期的海巴戟果實對乙烯敏感，隨著時間的增長能加速果實的軟化，因此推測海巴戟McXTH基因是海巴戟果實的成熟軟化的關(guān)鍵基因，參與調(diào)控海巴戟果實軟化，在果實軟化過程中起重要作用。后續(xù)擬將海巴戟McXTH基因構(gòu)建過表達載體，通過同源轉(zhuǎn)化及異源轉(zhuǎn)化進一步明確其功能。