張秋月，馬樂洵，鄭皓，吳涵，王凱，龔偉，王景燕，惠文凱

（四川農(nóng)業(yè)大學林學院/四川省長江上游林業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，成都 610000）

青花椒(Zanthoxylum armatumDC.)，又名竹葉花椒，為蕓香科(Rutaceae)多年生小喬木或灌木。常見的青花椒主要為純雌株，聚傘狀圓錐花序，單性不完全花中缺少花瓣，以無融合生殖為主要繁殖方式，因其特殊的清香麻味而受到消費者青睞[1]，是一種重要香料、油料、制藥兼用型經(jīng)濟樹種，亦是我國西部地區(qū)鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)之一，具有較高的研究和經(jīng)濟價值[2-3]。然而，近年來的野外觀察發(fā)現(xiàn)青花椒中出現(xiàn)大量雄花，且具有逐年增多趨勢，導致以孤雌生殖繁殖的青花椒結(jié)實產(chǎn)量顯著降低，嚴重影響其產(chǎn)業(yè)化推廣應用[4]。因此，探究青花椒花芽性別分化的關(guān)鍵調(diào)控基因，是揭示青花椒花芽性別分化的遺傳調(diào)控機制，解析青花椒雄花形成內(nèi)在原因的重要前提，對于研發(fā)雄花防控的性別調(diào)控技術(shù)和培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)青花椒種質(zhì)資源具有重要意義。

已有研究表明，被子植物花的結(jié)構(gòu)大致保守，由外向內(nèi)依次由萼片、花瓣、雄蕊和心皮四輪花器官組成[5]，并受到A、B和C這3類功能基因的聯(lián)合控制[6]。同時，花器官分化ABC模型的大多數(shù)基因都屬于MADS家族成員[7]，其編碼的蛋白主要由MADS-box、I間隔區(qū)、K-box和C末端4個保守程度不同的結(jié)構(gòu)域組成[8]，故又稱為MIKC型轉(zhuǎn)錄因子。其中，B類基因為APETALA3(AP3)/PISTILLATA(PI)亞家族成員，主要涉及雄蕊的分化過程，并能夠和A類基因協(xié)同調(diào)控花瓣的發(fā)育[9-10]。截至目前，已有多項研究分別報道了B類基因在花卉[11]、蔬菜[12-13]、水果[14]、木本植物[15]等不同類型植物中均具有調(diào)控雄蕊分化的重要作用。然而，盡管PI同源基因在部分物種中已研究得十分透徹，但不同物種的PI基因數(shù)量和調(diào)控效果存在差異。研究表明，擬南芥中共鑒定到3個PI/AP3家族成員，其中pi-1的調(diào)控作用最為明顯[16]。與此類似，雪香蘭的7個PI/AP3家族成員中，HoPI_3能夠顯著調(diào)控雄花序的分化形成[17]。目前，有關(guān)青花椒花芽性別分化過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因和遺傳調(diào)控機制未見報道。因此，探究青花椒PI/AP3家族的重要調(diào)控基因及其遺傳學信息，對于揭示青花椒雄蕊形成分子機制具有重要意義。

本研究結(jié)合課題組前期已有的青花椒雌雄花分化過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選并獲取了調(diào)控青花椒雄蕊分化的重要PI基因，并結(jié)合基因組數(shù)據(jù)成功克隆了該基因的編碼序列全長，開展了青花椒ZaPI的核酸和蛋白序列特征分析，解析了響應青花椒ZaPI的轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件。同時，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR技術(shù)，綜合性明確了ZaPI基因在青花椒根、莖、葉和刺等11種不同組織器官以及雌雄花分化10個時間點的表達模式。所獲研究結(jié)果為探索青花椒雄蕊形成的分子機制，研發(fā)雄花防控的性別調(diào)控技術(shù)提供了豐富的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 植物材料與儀器設(shè)備

本研究所用青花椒種植于四川省成都市崇州花椒試驗基地（103.66°E，30.566°N）。選取純雌株和純雄株青花椒各9株，在9月上旬當花芽長度達到3～5 mm時開始采樣，每隔10 d采集一次花芽，采集至次年3月，花芽開放后結(jié)束。每次采集時間為上午9：00-10：00。選擇粗細、長度、長勢相近的春梢作為取材對象，每枝選取6～10節(jié)位，每次至少1.5 g花芽，采集時選擇大小、長度基本一致的花芽。采樣使用無水乙醇消毒過的解剖刀直接取芽。每3株青花椒混合為一個樣品，共采集3次獨立來源的多個樣本生物重復。所有樣品采集后立即放入液氮保存后帶回實驗室放入-80 ℃冰箱保存。

本研究所用實驗耗材和儀器包括：植物RNA提取試劑盒(諾唯贊生物公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(莫納生物科技公司)、熒光定量PCR試劑盒(莫納生物科技公司)、常規(guī)PCRMix預混液、ZaPI基因引物、LB培養(yǎng)基、大腸桿菌DH5α(北京擎科生物科技公司)、無菌 ddH2O、核酸染料(北京擎科生物科技公司)、TAE溶液、瓊脂糖、臺式高速冷凍離心機、-80 ℃冰箱、凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)、常規(guī)PCR儀和熒光定量PCR儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 青花椒ZaPI基因的篩選與克隆

本研究結(jié)合課題組已公布的青花椒雌雄花分化過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GEO編號：GSE195749），從青花椒花芽性別分化差異基因數(shù)據(jù)集中提取AP3/PI基因家族成員[18]，分析所選基因在青花椒雌雄花分化過程的表達模式，初步確定青花椒AP3/PI家族中調(diào)控雄蕊分化的重要成員。

經(jīng)過上述分析，本研究最終確定Zardc17043為雄蕊分化顯著相關(guān)的候選基因，擬南芥注釋結(jié)果為B類基因PI。為確認ZaPI編碼序列的準確性，本研究從青花椒基因組數(shù)據(jù)庫中提取Zardc17043的編碼序列全長，并與克萊門柚(Citrus clementina)、煙草(Nicotiana tabacum)、白楊(Populus alba)和擬南芥的PI基因序列進行比對分析。同時，從本課題組前期構(gòu)建的青花椒不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GEO編號：GSE142491)，再次篩選同源基因序列，并利用Bioedit軟件將兩次所獲序列進行比對分析，綜合獲取完整的青花椒ZaPI基因編碼序列，并利用在線分析軟件ORF Finder(http://www.detaibio.com/sms2/orf_find.html)，明確該基因的開放閱讀框(open reading flame, ORF)和對應的氨基酸序列。

1.2.2 青花椒ZaPI基因的克隆與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

依據(jù)上述所得ZaPI基因編碼序列，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計特異性引物(表1)。取青花椒雄花樣品，使用RNA-easy Isolation Reagent提取RNA，并參照說明書的具體方法利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，通過PCR技術(shù)克隆目的基因。PCR擴增總體系為25 μL，包含2×Flash PCR MasterMix(Dye)12.5 μL，前后引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序設(shè)置為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，最后16 ℃保存?；厥誔CR產(chǎn)物，將其與T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，取含有目的基因片段的陽性克隆進行測序。引物合成及測序操作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 本研究所用引物序列信息表Table 1 Primer sequence information table used in this study

使用DNAMAN軟件，將測序結(jié)果與上述拼接所得序列進行比對，進一步確認青花椒ZaPI基因序列。隨后，再次與克萊門柚、煙草、白楊和擬南芥的PI蛋白序列進行比對分析，獲取ZaPI的蛋白結(jié)構(gòu)域信息。

1.2.3 青花椒ZaPI基因的系統(tǒng)進化分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中提取包括楊柳科(Salicaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、蕓香科(Rutaceae)等在內(nèi)的7科29種植物的CDS 序列。利用MEGA6.0軟件的鄰接法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建不同植物PI基因的系統(tǒng)進化樹，分析ZaPI蛋白的系統(tǒng)進化信息。

1.2.4 青花椒ZaPI染色體定位與基因結(jié)構(gòu)分析

從青花椒基因組數(shù)據(jù)中提取ZaPI基因的染色體定位信息，并利用TBtools軟件繪制青花椒ZaPI基因的染色體物理定位圖。通過GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)實現(xiàn)青花椒ZaPI基因結(jié)構(gòu)的可視化。

1.2.5 青花椒ZaPI基因的生物信息學分析

為進一步了解青花椒ZaPI基因的遺傳學信息，分別利用3種不同的專業(yè)在線生物信息學工具對其進行核酸和蛋白序列分析，具體包括：Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)、EMBOSS（https://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolresult.ebi?jobId=emboss_pepstats-I20230925-035905-0066-8271135-p1m）以及TBtools軟件[19]獲取ZaPI編碼的蛋白理化性質(zhì)；利用ExPASy(http://web.expasy.org/protscale/)、NetPhos-3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)以及NovoPro(https://www.novopro.cn/tools/tmhmm.html)進行ZaPI蛋白的疏水性、磷酸化位點和跨膜區(qū)預測；分別利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分析ZaPI的蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)，并利用拉氏圖檢測ZaPI蛋白三級構(gòu)象的合理性。

1.2.6 青花椒ZaPI的轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件分析

基于本研究克隆的青花椒ZaPI序列，通過PlantRegMap(http://plantregmap.gao-lab.org/index.php)軟件分析其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。隨后，從青花椒基因組數(shù)據(jù)庫中提取ZaPI基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp序列，提交至PlantCARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件預測。將得到的數(shù)據(jù)結(jié)果分別進行統(tǒng)計分析和整理繪圖。

1.2.7 青花椒ZaPI基因表達模式分析

為了綜合揭示ZaPI基因在青花椒中的組織特異性表達模式，本研究從課題組前期已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中提取ZaPI在根(Ro)、莖(St)、成熟葉(ML)、果實(Fr)和葉芽（LB）共計5個樣品中的表達豐度(GEO編號：GSE195749)。同時，從NCBI已公開的青花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，分析獲取了ZaPI在幼花(YF)、幼葉(YL)、果皮(Hu)、種子(Se)、頂芽（Bu）和皮刺(Pt)共計6個樣品的表達豐度(BioProject: PRJNA721257)。所有樣品的RNA-seq數(shù)據(jù)均有3次生物學重復。

同時，分別采集青花椒雌雄花分化10個分化時間點樣品，利用RNA快速提取試劑盒(諾唯贊，南京)提取各樣品的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)本研究所獲ZaPI編碼序列，利用Primer Premier 5設(shè)計特異性定量檢測引物（表1），利用qRT-PCR檢測ZaPI基因在各樣品中的表達模式。本研究以青花椒ZaUBQ作為內(nèi)參基因[20]，所有樣品的定量檢測設(shè)置3次生物學重復。以雌花分化第一個樣品為對照，利用2-ΔΔCt法計算不同樣品中ZaPI基因的相對表達水平，采用Duncan多重比較進行不同樣品間ZaPI相對表達量的差異分析，顯著性水平為P<0.05，利用GraphPad Prism 5繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花椒花芽性別分化基因的篩選

本研究從青花椒雌雄花分化的差異表達基因集中共獲得11個AP3/PI家族成員，其中包括3個ZaPI基因和8個ZaAP3基因（表2）?；虮磉_模式分析表明，所獲差異基因均在雄蕊成熟期（M4）顯著上調(diào)，而在雌花分化過程中表達量較低。同時，Zardc17043（ZaPI）在雄花M4時期的表達量是其他差異基因的15～90倍，且在雄花分化過程中呈現(xiàn)極顯著上調(diào)的高表達。上述結(jié)果表明，Zardc17043可能是參與青花椒雄花調(diào)控的AP3/PI家族重要成員。因此，本研究選取該基因作為青花椒雄蕊分化的關(guān)鍵調(diào)控基因進行后續(xù)分析和研究。

表2 青花椒雌雄花分化差異基因集AP3/PI基因家族成員的表達模式Table 2 Expression patterns of AP3/PI gene family members in the differentiation of male and female flowers in Sichuan pepper

2.2 青花椒ZaPI基因的克隆與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

本研究通過與其他物種PI基因比對分析發(fā)現(xiàn)，從青花椒基因組數(shù)據(jù)庫中所得Zardc17043編碼序列長度僅426 bp，缺失C-端蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1a)。然而，青花椒不同組織的無參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中所得同源基因Cluster-12235.70400的預測編碼序列長度為769 bp，與Zardc17043存在較高的同源性，但缺少蛋白翻譯的起始密碼子(圖1b)。因此，本研究將兩者拼接，成功獲得了一條長度為624 bp的編碼序列，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，共編碼207個氨基酸，初步確定為青花椒Zardc17043的編碼序列全長。

圖1 青花椒ZaPI基因蛋白結(jié)構(gòu)域分析Figure 1 Protein domain analysis of ZaPI gene in Sichuan pepper

為明確上述分析結(jié)果的準確性，本研究利用青花椒雄花的cDNA為模板進行了多次PCR擴增(圖2a)。結(jié)果表明，除序列N端存在一個氨基酸突變外，其余PCR擴增序列與上述拼接所得序列完全一致(圖2b, c)。此外，不同物種的PI蛋白序列比對結(jié)果表明，ZaPI蛋白含有典型的MADS-box(氨基酸序列第2～78位)和K-box (氨基酸序列第79～162位)結(jié)構(gòu)域，并具有相對完整的C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。上述結(jié)果表明，本研究已成功克隆了青花椒Zardc17043（ZaPI）的編碼序列全長。

2.3 青花椒ZaPI蛋白序列系統(tǒng)進化分析

29種植物的PI蛋白序列與青花椒ZaPI蛋白序列的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示（圖3），PI蛋白在同科內(nèi)保守性較高，本研究所獲青花椒ZaPI基因與同屬于蕓香科(Rutaceae)的克萊門柚(Citrus clementina)、甜橙(Citrus sinensis)、枳(Citrus trifoliata)和柑橘(Citrus reticulata)親緣關(guān)系較近。

圖3 青花椒ZaPI蛋白序列系統(tǒng)進化分析Figure 3 Systematic evolutionary analysis of ZaPI protein sequence in Sichuan pepper

2.4 青花椒ZaPI染色體定位與基因結(jié)構(gòu)分析

染色體定位結(jié)果顯示（圖4），ZaPI基因位于青花椒ZaChr11染色體。進一步的基因結(jié)構(gòu)分析表明，ZaPI基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，其中2號內(nèi)含子長度超過500 bp。

圖4 青花椒ZaPI基因定位與基因結(jié)構(gòu)分析Figure 4 Genomic localization and gene structure analysis of the ZaPI gene in Sichuan pepper

2.5 青花椒ZaPI基因的生物信息學分析

為了進一步了解青花椒ZaPI基因的相關(guān)信息，本研究對其進行了部分生物信息學分析。利用Protparam、Emboss和TBtools軟件預測的ZaPI編碼蛋白理化性質(zhì)結(jié)果顯示(表3)，ZaPI蛋白分子量為24.29 kD，pI (等電點)為9.48，不穩(wěn)定系數(shù)為53.73(穩(wěn)定蛋白閾值為40)，總體親水性系數(shù)為-0.876 (小于0為親水性，反之為疏水性)，這說明ZaPI是一個不穩(wěn)定的親水性蛋白。通過ExPASy軟件分析發(fā)現(xiàn)(圖5a)，ZaPI蛋白中第47位氨基酸的平均疏水指數(shù)最大(2.256)，而第191位氨基酸的平均疏水指數(shù)最小(-3.333)。蛋白磷酸化位點預測結(jié)果顯示(圖5b)，ZaPI蛋白中具有19個絲氨酸(Serine)位點、7個蘇氨酸(Threonine)位點和5個酪氨酸(Tyrosine)位點，這31個蛋白磷酸化位點可能是調(diào)控ZaPI蛋白活性和功能的重要組成部分。此外，生信分析結(jié)果表明，ZaPI蛋白無跨膜螺旋區(qū)(圖5c)，主要由α螺旋，無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成(圖5d)，能夠形成蛋白二聚體(圖5e)。拉氏圖評估結(jié)果表明，上述分析所得蛋白三級模型的構(gòu)象符合立體化學規(guī)則(圖5f)。

圖5 青花椒ZaPI蛋白序列的生物信息學分析Figure 5 Bioinformatic analysis of the ZaPI protein sequence in Sichuan pepper

表3 青花椒ZaPI蛋白理化性質(zhì)分析Table 3 Physicochemical properties analysis of the ZaPI protein in Sichuan pepper

2.6 青花椒ZaPI的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和順式作用元件分析

為了更好地了解青花椒ZaPI基因的潛在功能和調(diào)控基因，利用PlantRegMap軟件對其進行預測，共獲得包括BBR-BPC、MIKC_MADS、C2H2和MYB等17類轉(zhuǎn)錄因子家族的54個結(jié)合位點(圖6a)，其中BBR-BPC的結(jié)合位點數(shù)量最多，共10個，占19%；其次是MIKC_MADS，共9個，占17%。這些轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控植物生殖生長、生理代謝、細胞分化等生長發(fā)育過程顯著相關(guān)，暗示ZaPI可能與這些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控青花椒雄蕊的分化過程。

圖6 青花椒ZaPI的轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件分析Figure 6 Transcription factor and cis-acting element analysis of ZaPI in Sichuan pepper

順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)(圖6b)，ZaPI基因共含有31種順式作用元件。除啟動子本身具有的CAATbox和TATA-box等特征性元件外，還包括6類響應元件，分別是占比9%的激素響應元件(包括脫落酸ABRE、茉莉酸甲酯CGTCA-motif和TGACG-motif及赤霉素TATC-box)、8%的光反應元件(G-box、GATA-motif、ATCT-motif、I-box、Gap-box、GT1-motif及AE-box)、7%的MYB響應元件(包括MYB、MBS、CCAAT-box及Myb-binding site)、3%的厭氧誘導調(diào)節(jié)元件(ARE)以及2%的防御與應激反應元件(TCrich repeats)和分生組織表達響應元件(CAT-box)。該結(jié)果表明，ZaPI基因可能存在多種信號響應模式，參與了青花椒不同的生命活動過程，是潛在植物激素和光信號響應因子，可能受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的互作調(diào)控，并在逆境條件下調(diào)控植物生殖生長過程中發(fā)揮著重要作用。

2.7 青花椒ZaPI基因的表達模式分析

組織特異性分析結(jié)果表明(圖7a)，青花椒ZaPI在根莖葉刺等11種不同組織器官中幾乎不表達，僅在果實中表達量相對較高。此外，為進一步明確本研究所選ZaPI基因在青花椒性別分化過程的表達情況，本研究利用雌雄蕊分化的10個時間點樣品進行了qRT-PCR檢測分析。結(jié)果表明(圖7b)，青花椒ZaPI基因在雌雄花分化過程中存在極顯著差異。ZaPI主要在雄花中表達，并隨著雄蕊的分化表達量逐漸上調(diào)，在12月雄蕊形成期和2－3月份雄蕊成熟期表達量顯著提高，尤其是后者的表達量呈指數(shù)級上調(diào)。然而，ZaPI在青花椒整個雌花分化過程的表達量持續(xù)處于相對較低水平。上述結(jié)果與B類基因的基本功能吻合，表明本研究所獲ZaPI基因在青花椒雄花分化過程中具有重要的調(diào)控作用。

圖7 青花椒ZaPI基因表達量及定量檢測結(jié)果Figure 7 Transcription factor and cis-acting element analysis of ZaPI in Sichuan pepper

3 討論

植物具有相對復雜的性別分化遺傳機制[21]，而現(xiàn)階段有關(guān)青花椒性別分化的分子機制暫未可知。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青花椒花芽分化過程中雌雄蕊原基的選擇性敗育導致了單性花的形成[18]。本研究以青花椒組學數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆了參與雄蕊分化的ZaPI基因，該序列編碼的蛋白與擬南芥、克萊門柚等多種植物的PI蛋白序列具有較高相似性，且擁有典型的MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域，是一個不穩(wěn)定的親水二聚體蛋白，大部分結(jié)構(gòu)為α螺旋。據(jù)文獻記載，B類基因高度保守的 MADS 結(jié)構(gòu)域具有與DNA結(jié)合等功能；而含有親水性α螺旋的K結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛纬葾P3/PI異源二聚體在花發(fā)育過程中非常重要[16,22]，本研究所獲ZaPI基因序列存在上述完整的結(jié)構(gòu)域特征，暗示該序列具有發(fā)揮PI基因活性的能力。此外，PI基因作為ABC模型的B類調(diào)控基因，與植物的雄蕊分化過程顯著相關(guān)[23]。

已有研究表明，桂花過表達PI同源基因致使生育期縮短、開花時間提前[24]。木本植物阿甘樹(Argania spinosa)的AsPI基因和克萊門柚的PI-like基因CcMADS20在雄蕊和花瓣中呈極顯著表達，而在營養(yǎng)器官中表達量極少[25-26]。同時，楸樹(Catalpa bungei)CabuPI基因和東方綠藻(Chloranthaceae)HoPI基因的表達也僅限于花瓣和雄蕊，這些PI的過表達均能夠挽救pi突變體擬南芥花瓣和雄蕊異常發(fā)育的表型缺陷[17,27]。與此類似，本研究ZaPI基因主要在雄花分化的形成期和成熟期高表達，而在營養(yǎng)器官中表達量極低或未檢測到表達。這些結(jié)果暗示本研究所獲ZaPI基因可能參與了青花椒雄蕊的性別分化過程，并在調(diào)控雄花分化和雄蕊形成中起重要作用。后續(xù)研究可借助模式植物遺傳轉(zhuǎn)化等實驗，進一步探究ZaPI基因的生物學功能，從而揭示其在青花椒雄蕊分化過程中的重要作用。

此外，本研究從青花椒ZaPI基因中檢測到大量C2H2、MYB、WRKY、NAC和 MIKC_MADS等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這些轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與到植物生長發(fā)育過程中。已有研究表明，PI基因的過表達能夠顯著提高番茄的耐鹽性，并促使MYB轉(zhuǎn)錄因子表達量顯著上調(diào)[28]。同時，PI基因的高表達與高粱的抗病性顯著相關(guān)[29]，且可導致高粱開花時間顯著提前。近期研究發(fā)現(xiàn)，三葉木通的AktWRKY19在雄花中極顯著高表達，而雌花中表達量極低[30]。擬南芥中的WRKY2和WRKY34能夠顯著調(diào)控雄蕊花粉的發(fā)育過程[31]。這些結(jié)果表明ZaPI基因可能在開花時間調(diào)控、逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導、病蟲害防御等方面發(fā)揮重要作用[32-35]。在后續(xù)研究中，可通過酵母單/雙雜交、凝膠遷移等分子遺傳學手段，探究ZaPI基因與上述轉(zhuǎn)錄因子的互作效應。

啟動子是位于基因編碼區(qū)上游，富含順式作用元件，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列[36]。本研究ZaPI基因啟動子區(qū)域預測到31種順式作用元件，其中涉及大量的植物激素響應元件，尤其是茉莉酸甲酯、赤霉素和脫落酸信號轉(zhuǎn)導通路。研究發(fā)現(xiàn)，玉米PI-like基因的順式作用元件，特別是與茉莉酸甲酯（MeJA）和赤霉酸（GA）這兩種激素相關(guān)的元件，在MeJA和GA的外源處理下，影響了PI基因的表達，減少了玉米雄蕊的數(shù)量[37]。同時，已有研究證明外源水楊酸（SA）處理后郁金香PI基因表達量上調(diào)，并促進了郁金香花瓣的衰老[38]。此外，番茄SlPI基因的厭氧誘導調(diào)節(jié)元件ARE數(shù)量較多，在厭氧條件下轉(zhuǎn)錄因子可與ARE結(jié)合誘導PI基因的表達[28]。綜上所述，PI基因可能通過響應植物激素信號傳導通路以及花芽分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控雄蕊分化過程。因此，在后續(xù)研究中可以觀察外源茉莉酸甲酯、赤霉素和脫落酸處理后的青花椒ZaPI基因表達活性變化，確定青花椒ZaPI是否能夠響應植物激素信號，調(diào)控雄花的分化過程，從而為青花椒雄花調(diào)控技術(shù)研發(fā)提供豐富的理論支撐和技術(shù)參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合青花椒轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，成功克隆了一條長度為624 bp的ZaPI基因完整編碼序列，并利用蛋白結(jié)構(gòu)域分析、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、染色體定位、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及順式作用元件預測等方法對其進行了綜合的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)ZaPI基因可能響應植物激素、光照以及逆境脅迫等信號通路，調(diào)節(jié)青花椒的花器官分化過程。此外，轉(zhuǎn)錄組學和實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，該基因在青花椒營養(yǎng)器官中幾乎不表達，雌花分化過程的表達量也相對較低，但在雄花分化過程中表達量極顯著上調(diào)，暗示其可能顯著參與了青花椒雄蕊分化的遺傳調(diào)控過程。本研究所獲結(jié)果，對于進一步探究青花椒雄蕊形成的分子機制，培育高產(chǎn)青花椒種質(zhì)資源提供了豐富的理論支撐。