唐孝富，孟銀銀，杜瑩，蒲靖，王苗，田錕，鄧群仙，張慧芬

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130）

休眠是高等植物經(jīng)過長(zhǎng)期演化而獲得的一種對(duì)環(huán)境條件及季節(jié)變化的生物學(xué)適應(yīng)性，直接與開花、萌芽相關(guān)[1-2]。Lang G.A.等[3]于1987年對(duì)休眠進(jìn)行了重新定義和分類，基于引起休眠的因素將其分為三大類：類休眠，指休眠結(jié)構(gòu)以外的生理因素(如頂端優(yōu)勢(shì)、激素等)誘導(dǎo)產(chǎn)生的生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象；內(nèi)休眠，指休眠結(jié)構(gòu)本身的因素(如冷溫需求、光周期影響)控制的生長(zhǎng)停滯現(xiàn)象；生態(tài)休眠，是指由環(huán)境因子(如溫度、水分脅迫、營(yíng)養(yǎng)虧缺等)引起的休眠，一旦環(huán)境條件適宜，植物便可重新恢復(fù)生長(zhǎng)。多年生果樹通過芽休眠抵御自然界不利環(huán)境，而芽一般需要達(dá)到一定低溫需冷量才能解除休眠進(jìn)行正常生長(zhǎng)發(fā)育[4-6]。陳茂銓等[7]對(duì)12個(gè)桃品種的花芽休眠需冷量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同品種需冷量差異較大，其中高需冷量品種在猶他模型下達(dá)900～950 CU。近幾年，湯志洪[8]、陳登文等[9]研究歐李冬季休眠特性發(fā)現(xiàn)，歐李花芽的需冷量低于葉芽，花芽與葉芽自然休眠過程中對(duì)有效低溫的累積要求存在差異。

休眠是多基因協(xié)同控制的過程，近年來，關(guān)于芽休眠相關(guān)基因的研究較多。D.G.Blelenberg等[10]最早在桃的休眠障礙型突變體上發(fā)現(xiàn)MIKC-type MADS-box轉(zhuǎn)錄因子控制了芽休眠和分生組織生長(zhǎng)，將其命名為dormancy associated MADS-box gene（DAM）[11-12]。DAM基因與植物體的開花及花器官的形成有密切關(guān)系，在桃、梨等薔薇科果樹中研究廣泛[13-15]，李海炎等[16]在桃的DAM基因調(diào)控需冷量的研究中發(fā)現(xiàn)，不同需冷量的桃在休眠過程中DAM基因的表達(dá)模式一致，隨休眠解除DAM表達(dá)逐漸下降，且DAM基因在高需冷量的品種的表達(dá)量高于低需冷量品種的表達(dá)。楊高宇等[17]利用PacBio和high-c技術(shù)構(gòu)建低需冷量梨品種的基因組組合，進(jìn)一步確定梨的DAM基因?qū)ρ棵葎?dòng)的抑制作用。楊依維等[18]對(duì)歐李休眠誘導(dǎo)的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，DAM5基因的表達(dá)隨著休眠誘導(dǎo)進(jìn)程逐漸升高，DAM5基因在誘導(dǎo)歐李芽休眠中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來有研究者針對(duì)李的花芽休眠相關(guān)MADS-box基因的克隆及其對(duì)花芽發(fā)育和休眠的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，DAM轉(zhuǎn)錄因子在溫暖季節(jié)開始積累，且隨著溫度的降低逐漸增加，從而誘導(dǎo)芽休眠[19]。

李為薔薇科李屬植物，作為一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹，在我國(guó)廣泛種植，其中四川省主栽品種主要為‘羌脆李’和‘脆紅李’。李樹需冷量與芽休眠的解除是影響開花坐果的重要因素。本研究以‘脆紅李’‘羌脆李’及‘羌脆李’的晚熟變異材料“晚熟羌脆李”為研究材料，對(duì)花芽與葉芽需冷量的進(jìn)行比較，并用生物信息學(xué)方法對(duì)李DAM基因的序列結(jié)構(gòu)和芽不同休眠狀態(tài)的表達(dá)量分析，為四川李栽培生產(chǎn)中芽休眠調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘羌脆李’‘脆紅李’及“晚熟羌脆李”枝條與芽均采樣自四川省阿壩藏族羌族自治州汶川縣茅嶺村（31°28′ N，103°33′ E）果園?！巴硎烨即嗬睢睘橐N定植的100株‘羌脆李’中發(fā)現(xiàn)的芽變優(yōu)株，該優(yōu)株和同一批定植的‘羌脆李’相比，果實(shí)晚成熟約30 d左右。成熟期與當(dāng)?shù)亍嗉t李’基本一致?！巴硎烨即嗬睢薄即嗬睢约啊嗉t李’芽休眠狀態(tài)觀察于2020年11月李全樹落葉后開始，至2021年1月全部觀察芽解除芽休眠，觀察期間每間隔14 d從掛牌李樹上選取生長(zhǎng)發(fā)育良好、芽體飽滿的1年生枝條5枝，用于花芽、葉芽取樣，在液氮中預(yù)冷后立即放入-80 ℃超低溫冰箱中保存用于RNA提取。

在NCBI網(wǎng)站下載與李相近的同源物種桃的DAM1-6基因序列，本地Blast在歐李基因組中查找到6個(gè)李DAM基因，分別命名為PdDAM1、PdDAM2、PdDAM3、PdDAM4、PdDAM5和PdDAM6。

1.2 萌芽率統(tǒng)計(jì)

2020年11月—2021年1月芽休眠觀察期間，每隔14 d從3個(gè)品種（系）李樹上各選取生長(zhǎng)發(fā)育良好、芽體飽滿的1年生枝條6枝，用于人工培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)萌芽率[20-21]，每次采樣各品種（系）用于觀察統(tǒng)計(jì)的花芽與葉芽數(shù)量均為60個(gè)以上。將采回的枝條基部斜剪45°，放在盛有清水的燒杯中，以淹沒枝條基部，立即放入人工氣候箱培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照12 h，光照強(qiáng)度320 μmol/(m2·s)，黑暗12 h；溫度為（25±1.0）℃/（18±1.0）℃；空氣相對(duì)濕度為75%；每2 d換1次水，每次換水剪除枝條基部少許。培養(yǎng)21 d時(shí)統(tǒng)計(jì)萌芽率，以芽頂端開裂露綠為萌芽標(biāo)準(zhǔn)，以萌芽率>50%時(shí)的觀測(cè)日期為解除內(nèi)休眠的日期[22-23]。參照Lang G.A.等[3]的方法[3]，確定休眠的階段：以萌芽率為0時(shí)，芽完全處于內(nèi)休眠階段；萌芽率為0～50%時(shí)，芽處于內(nèi)生態(tài)休眠轉(zhuǎn)換階段；萌芽率為≥50%時(shí)，即認(rèn)定芽解除內(nèi)休眠進(jìn)入生態(tài)休眠階段。

1.3 需冷量計(jì)算

觀察期間于田間裝置溫濕度計(jì)，設(shè)置為每隔15 min讀數(shù)1次，實(shí)時(shí)記錄田間溫濕度。分別統(tǒng)計(jì)7.2 ℃模型、0～7.2 ℃模型和猶他模型的低溫累積數(shù)。

7.2 ℃模型[24]：低溫積累量以日平均溫度穩(wěn)定通過7.2 ℃的日期為起點(diǎn)，計(jì)算小于7.2 ℃低溫小時(shí)數(shù)（chilling hour，CH），當(dāng)每小時(shí)溫度≤7.2 ℃時(shí)，計(jì)1個(gè)低溫小時(shí)數(shù)。

0～7.2 ℃模型[25]：低溫積累量以日平均溫度穩(wěn)定通過7.2 ℃的日期為起點(diǎn)，計(jì)算0～7.2 ℃的低溫小時(shí)數(shù)（chilling hour，CH），當(dāng)每小時(shí)溫度處于0～7.2 ℃范圍內(nèi)，計(jì)1個(gè)低溫小時(shí)數(shù)。

猶他模型[26]：低溫積累量以負(fù)累積低溫達(dá)到最大值時(shí)的日期為起點(diǎn)計(jì)算積累的冷溫單位（chilling unit，CU），每小時(shí)溫度與冷溫單位轉(zhuǎn)化如表1所示。

表1 溫度冷溫單位轉(zhuǎn)化表Table 1 Transformation of temperature and chilling unit

1.4 李DAM基因進(jìn)化樹和保守motif分析

利用MEMEM在線軟件對(duì)李DAM蛋白的保守基序進(jìn)行分析，基序的最大數(shù)目設(shè)置為10，TBtools軟件[27]對(duì)DAM基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與作圖。利用Clusta1X進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，MEGA11對(duì)李與其他植物的DAM氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.5 李DAM 基因qRT-PCR分析

3個(gè)品種（系）李花芽、葉芽RNA的提取參照宣繼萍等[28]的CTAB法[28]。cDNA的合成使用Goldenstar?RT 6 cDNA Synthesis Ver.2（北京擎科生物公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作參照說明書。引物設(shè)計(jì)采用Beacon Designer 7 (Version 7.9, Premier Biosoft, San Francisco, USA），具體引物信息見表2。以李TUB3為內(nèi)參基因。使用BIO-RAD CFX96定量PCR儀進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)：體系為10 μL，包含2× TSINGKE?Master qPCR Mix (SYBR GreenⅠ） 5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA2 μL，ddH2O 2.2 μL。2步法擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)處理包含3個(gè)重復(fù)。采用2-??Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 DAM 基因qRT-PCR 引物序列Table 2 Primer sequences of DAM gene for real-time quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理分析

使用Microsoft Excel 2021和Graph Pad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌芽率統(tǒng)計(jì)

由圖1可知，“晚熟羌脆李”與‘羌脆李’‘脆紅李’的花芽萌芽率差異較大，“晚熟羌脆李”花芽從11月5日—12月5日萌芽率未達(dá)到50%，為內(nèi)休眠狀態(tài)，12月20日時(shí)為生態(tài)休眠階段，萌芽率為84.0%。‘羌脆李’‘脆紅李’花芽萌芽率較一致，在11月5日到11月20日萌芽率小于50%，該階段處于內(nèi)休眠狀態(tài)，12月5日開始萌芽率大于50%并且之后逐漸上升，達(dá)到解除內(nèi)休眠的標(biāo)準(zhǔn)，處于生態(tài)休眠階段，12月5日萌芽率高低依次為‘羌脆李’>‘脆紅李’>“晚熟羌脆李”，“晚熟羌脆李”花芽的內(nèi)休眠時(shí)間最長(zhǎng)。3個(gè)品種（系）葉芽萌芽率相似，均表現(xiàn)為11月5日萌芽率小于50%，處于內(nèi)休眠狀態(tài)，從11月20日開始葉芽萌芽率大于50%內(nèi)休眠狀態(tài)解除。3個(gè)品種（系）葉芽休眠解除臨界期均為11月5日—11月20日。3個(gè)品種（系）花芽休眠解除臨界期不同，“晚熟羌脆李”為12月5日至12月20日，‘羌脆李’和‘脆紅李’均為11月20日至12月5日，3個(gè)品種（系）葉芽解除臨界期相同，為11月5日至11月20日。

圖1 花芽、葉芽不同時(shí)期萌芽率Figure 1 Germination rate of flower buds and leaf buds at different periods

2.2 休眠芽低溫需冷量分析

結(jié)合田間溫濕度記錄儀溫度記錄與室內(nèi)培養(yǎng)箱萌芽率統(tǒng)計(jì)，使用7.2 ℃模型、0～7.2 ℃模型和猶他模型分別計(jì)算3個(gè)李品種（系）的低溫需冷量（表3）。結(jié)果表明，3種計(jì)算模型下，‘羌脆李’與‘脆紅李’需冷量均相同且低于“晚熟羌脆李”，7.2 ℃模型下花芽需冷量最高，“晚熟羌脆李”需冷量為943 CH，‘羌脆李’與‘脆紅李’需冷量為630 CH。同一模型下3個(gè)品種（系）葉芽需冷量均相同?！巴硎烨即嗬睢?、‘羌脆李’和‘脆紅李’的花芽、葉芽解除休眠的低溫需冷量所反映的物候?qū)W模型與三者芽休眠狀態(tài)調(diào)查結(jié)果一致。

表3 3 個(gè)李品種（系）低溫需冷量Table 3 Low temperature chilling requirement of 3 plum materialsCH

2.3 李DAM基因進(jìn)化樹和保守motif分析

利用李（Prunus domestica）、桃（Prunus persica）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、杏（Prunus armeniaca）、梅（Prunus mume）、蘋果（Malus pumila）、葡萄（Vitis vinifera）和楊樹（Populus talassica）DAM蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，8個(gè)物種35個(gè)蛋白可聚類為3個(gè)亞族，李6個(gè)DAM在3個(gè)亞族內(nèi)均有分布。將李DAM家族的保守基序及其系統(tǒng)進(jìn)化樹使用TBtools軟件進(jìn)行整/合可視化作圖（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，李的PdDAM1、PdDAM2、PdDAM3、Pd-DAM4、PdDAM5、PdDAM6分別與PpDAM6、Par-DAM5、PtMADS5、PmDAM3、PpDAM1、MdDAM1進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性最高。MEME 網(wǎng)站在線分析預(yù)測(cè)35個(gè)DAM蛋白的保守motif，除蘋果3個(gè)DAM與梅PmDAM5外，其他序列均含4個(gè)相對(duì)保守的motif: motif9-motif1-motif3-motif2，且motif之間的排列具有一定的規(guī)律性，6個(gè)李DAM蛋白序列motif排列順序均為: motif9-motif1-motif3-motif5-motif2-motif6-motif4-motif8-motif7-motif10，而Pd-DAM4缺少motif8和motif7，PdDAM2基因缺少1個(gè)motif6。這些結(jié)果表明李DAM家族成員在序列較相似，PdDAM4與PdDAM2出現(xiàn)1～2個(gè)基因出現(xiàn)保守基序缺失或增加的現(xiàn)象，可能是進(jìn)化過程中出現(xiàn)了序列結(jié)構(gòu)差異。

圖2 李DAM基因進(jìn)化樹及保守基序Figure 2 Prunus DAM gene evolutionary tree and conserved motif order

2.4 休眠相關(guān)DAM基因qRT-PCR分析

休眠相關(guān)基因DAM在“晚熟羌脆李”‘羌脆李’和‘脆紅李’休眠期花芽與葉芽的相對(duì)表達(dá)量的變化如(圖3)所示，3個(gè)李品種（系）的花芽與葉芽?jī)?nèi)休眠解除臨界期表達(dá)基因相同，且在內(nèi)休眠解除臨界期DAM基因的相對(duì)表達(dá)量基本呈下降趨勢(shì)?！巴硎烨即嗬睢被ㄑ颗c葉芽?jī)?nèi)休眠解除臨界期均表現(xiàn)為DAM4和DAM5表達(dá)最高，其中DAM5在花芽與葉芽中的表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，而DAM4在花芽中為下降趨勢(shì)，在葉芽中卻呈緩慢上升趨勢(shì)；‘羌脆李’花芽與葉芽?jī)?nèi)休眠解除臨界期內(nèi)隨著休眠的解除DAM1和DAM5表達(dá)最高，呈逐漸下降趨勢(shì)；‘脆紅李’休眠解除臨界期DAM2和DAM5表達(dá)最高，且呈逐漸下降趨勢(shì)?？傮w而言，無(wú)論是“晚熟羌脆李”‘羌脆李’還是‘脆紅李’的花芽還是葉芽在達(dá)到解除內(nèi)休眠的過渡階段均有DAM5為主要的調(diào)控基因，而在內(nèi)休眠轉(zhuǎn)變?yōu)樯鷳B(tài)休眠的階段，DAM基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，DAM基因表達(dá)下降與休眠解除密切相關(guān)。

圖3 “晚熟羌脆李”花芽（A1）、“晚熟羌脆李”葉芽（A2）、‘羌脆李’花芽（B1）、‘羌脆李’葉芽（B2）、‘脆紅李’花芽（C1）、‘脆紅李’葉芽（C2）中DAM基因的表達(dá)分析Figure 3 Expression analysis of DAM genes of "Wanshuqiangcuili" flower buds (A1), "Wanshuqiangcuili" leaf buds (A2),'Qiangcuili' flower buds (B1), 'Qiangcuili' leaf buds (B2), 'Cuihongli' flower buds (C1), and 'Cuihongli' leaf buds (C2)

3 討論與結(jié)論

落葉果樹具有明顯的季節(jié)性生長(zhǎng)規(guī)律，休眠為果樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要時(shí)期[29-30]。休眠除了受外界環(huán)境的影響之外，通常還受解除休眠需冷量、休眠相關(guān)DAM基因的多重控制[31]。一般不同的樹種，或者同一樹種不同品種品系的低溫需冷量不同，休眠期時(shí)間長(zhǎng)短也不一致，如柿、蘋果等樹種之間休眠不同[32-35]。棗樹研究中，低溫需冷量較小的“京棗39”在12月上旬結(jié)束休眠，“辣椒棗”“七月鮮”等低溫需冷量中等的在1月下旬結(jié)束休眠，低溫需冷量較大的“大樹冬棗”在2月初結(jié)束休眠[36]。本研究中3個(gè)李品種（系）花芽需冷量不同，“晚熟羌脆李”較‘羌脆李’需冷量高，果實(shí)成熟期也延遲。陳菲菲[37]在桑葚休眠與果實(shí)熟期的研究結(jié)果也表明，不同休眠時(shí)期對(duì)產(chǎn)量無(wú)顯著影響，但休眠提前解除，果實(shí)熟期也提前。因此在生產(chǎn)上利用休眠期的合理管理來進(jìn)行產(chǎn)期的調(diào)控。本研究對(duì)3個(gè)不同李品種（系）的花芽和葉芽的休眠狀態(tài)、低溫需冷量分析發(fā)現(xiàn)，“晚熟羌脆李”花芽從12月20日萌芽率大于50%，解除了內(nèi)休眠，‘羌脆李’和‘脆紅李’在12月5日處于解除深休眠狀態(tài)；對(duì)于葉芽，3個(gè)品種（系）均在11月20日達(dá)到解除內(nèi)休/眠狀態(tài)。需冷量的差異與休眠狀態(tài)一致，且3者葉芽需冷量無(wú)差異，而解除休眠最晚的“晚熟羌脆李”花芽的需冷量最高。

DAM基因是果樹休眠變化的重要調(diào)控基因，在桃樹中發(fā)現(xiàn)存在6個(gè)DAM基因[10],中國(guó)櫻桃中發(fā)現(xiàn)3個(gè)DAM基因[13]，本研究通過與李近緣物種桃的DAM1-6比對(duì)，以歐李基因組為參考查找到6個(gè)李DAM基因。H.Yamane等[38-39]研究了需冷量高低的不同品種的桃，結(jié)果表明，休眠期PpDAM5和Pp-DAM6均存在相對(duì)較高的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是“晚熟羌脆李”‘羌脆李’還是‘脆紅李’，均表現(xiàn)為隨休眠狀態(tài)解除DAM的相對(duì)表達(dá)逐漸下調(diào)，在休眠解除臨界期表達(dá)下調(diào)最顯著，且DAM5可能是3個(gè)品種（系）中共有的調(diào)控休眠的關(guān)鍵基因，這與歐李DAM5促進(jìn)休眠，抑制萌發(fā)[18]研究結(jié)果一致?！巴硎烨即嗬睢被ㄑ恐械腄AM基因表達(dá)高峰均晚于‘羌脆李’與‘脆紅李’，與花芽需冷量及休眠觀察結(jié)果一致。需冷量與DAM表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，“晚熟羌脆李”的內(nèi)休眠解除要晚于‘羌脆李’，這也可能是“晚熟羌脆李”較‘羌脆李’果實(shí)熟期推遲的原因之一，休眠解除較遲，萌動(dòng)也會(huì)相應(yīng)有所推遲，同時(shí)樹體所消耗的營(yíng)養(yǎng)也隨之增多，體內(nèi)提供生長(zhǎng)養(yǎng)分變少，影響花期、坐果甚至果實(shí)熟期[40]。