侯雨微，岳毓菁，李川，蘇帥，易洪楊，曹墨菊

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，成都 611130）

玉米不僅是集糧、飼、經(jīng)濟于一體的多元化作物，而且它在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中扮演著極其關(guān)鍵的角色。光合反應(yīng)既是綠色植物獲得能量和營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵路徑，也是保障植物進行正常生長和發(fā)育等生命活動中不可或缺的條件。葉綠體則是執(zhí)行光合反應(yīng)的主要場所，擔任轉(zhuǎn)化光能的核心任務(wù)[1]，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對植株的生長發(fā)育有著直接的影響[2]，葉綠素是植物吸收、轉(zhuǎn)移光能并將其轉(zhuǎn)化為生物能的重要執(zhí)行者，葉綠素合成過程中出現(xiàn)任何偏差都將會對植物的葉色造成影響。

葉片的顏色是葉綠體中各種色素的綜合體現(xiàn),當玉米葉片處于正常生長狀態(tài)時，葉綠體結(jié)構(gòu)完整,其含量也較為豐富,這使得色素能夠正常合成,通常表現(xiàn)為深綠色[3]。葉綠體發(fā)育、葉綠素的合成與分解、血紅素的合成與代謝遭到破壞，都會引起葉片顏色的改變。葉綠體是由原質(zhì)體分化而來。在分化期間，會形成類囊體并將其堆疊成正確的基粒片層結(jié)構(gòu)，光合蛋白復(fù)合物分布在類囊體膜上，因此類囊體膜又被稱為光合膜，是葉綠體最重要的結(jié)構(gòu)之一[4]。在葉綠體發(fā)育過程中，葉綠素的積累和類囊體膜的構(gòu)建均為關(guān)鍵步驟，它們之間緊密相連，相互影響。

植物中葉色突變是一種常見的遺傳變異現(xiàn)象，這種突變通常是由于葉綠素的合成受阻或葉綠素的降解加快所導(dǎo)致,葉綠素是植物進行光合作用的重要物質(zhì)，會直接影響植物的光合作用效率，進而影響植物的生長和發(fā)育。因此，葉色突變體又被稱為葉綠素缺陷突變，這種突變體通常具有生長緩慢、產(chǎn)量下降等不良表現(xiàn)[5]。葉綠素缺陷突變目前普遍認為存在兩種可能，一種是由于葉綠體形成所需特定蛋白質(zhì)的突變，進而妨礙了葉綠素的合成；另一種是催化葉綠素合成酶的編碼基因發(fā)生突變，從而擾亂了葉綠素的合成過程[6]。ELM1基因在植物葉片發(fā)色團的生物合成中起著決定性的作用，調(diào)控植物色素蛋白合成酶的產(chǎn)生，當玉米中ELM1基因發(fā)生突變時，會導(dǎo)致光敏色素缺乏，從而使幼苗展現(xiàn)淺綠色的葉片和節(jié)間，同時其葉綠素含量也會相比與野生型變低[7]。擬南芥黃化突變體hy1和hy2也都是由于光敏色素合成酶活性改變使發(fā)色團的合成受到影響，從而導(dǎo)致黃化表型[8-9]。ELM2編碼血紅素加氧酶（Heme oxygenase，HO），也參與光敏色素的生物合成，調(diào)節(jié)血紅素含量和類囊體堆積。類囊體的發(fā)育是一個精細而復(fù)雜的生物過程，它涉及到多個層面的調(diào)控機制。在這個過程中，核基因和轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮著核心作用，這些基因和蛋白通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控類囊體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，同時囊泡的聚集和增殖在類囊體的形成過程中也扮演著至關(guān)重要的角色[10]。這個過程需要眾多酶和蛋白因子的參與和催化，它們協(xié)同工作，確保類囊體的正常發(fā)育，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能導(dǎo)致葉綠體發(fā)育不良，進而影響植物的生長和發(fā)育。如elm2[11]、ygl-1[12]和csr1[13]等。葉綠素的合成始于谷氨酸，經(jīng)過20步反應(yīng)之后，才能最終生成葉綠素a[14]，葉綠素b是由葉綠素a為前體形成的，它是捕光色素蛋白復(fù)合體進入類囊體膜中所必需的[15]，缺乏葉綠素b植物的葉綠體類囊體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)會發(fā)生改變，體現(xiàn)在基粒數(shù)量的下降和基質(zhì)的擴張[16]，在整個葉綠素合成過程中，復(fù)雜反應(yīng)鏈條任何一環(huán)節(jié)中所涉及的酶的活性變動都可能對葉綠素的含量產(chǎn)生影響，并可能發(fā)生一系列連鎖反應(yīng)，最終將導(dǎo)致植物葉色的改變。玉米葉色突變體的類型繁多，表型也是復(fù)雜多樣，然而對于葉色形成的機理和途徑，目前的研究還不夠充分和深入，主要停留在對形態(tài)、葉綠素含量、葉綠體結(jié)構(gòu)、光合效率以及生物學(xué)產(chǎn)量等方面的描述。因此，鑒定和研究葉色突變基因，探索其作用機制和調(diào)控方式，具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價值。

課題組前期通過60Co-γ射線處理玉米自交系齊319，獲得了一份永久性失綠突變體chs10（Permanent chlorosis 10）。本研究以該突變體為材料，對其表型進行鑒定及遺傳分析；測定不同時期chs10葉片的葉綠素含量，觀察chs10葉片的葉綠體結(jié)構(gòu)；將其與Mo17組配獲得F2分離群體從而對chs10進行基因定位；基于候選基因分析并結(jié)合qRT-PCR確定了關(guān)鍵候選基因Zm00001d025860；分析了Zm00001d025860在不同時期不同組織中的表達模式，并對其所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進行了同源性比對；檢測了Zm00001d025860蛋白在細胞內(nèi)的定位結(jié)果。此研究不僅豐富了玉米葉色突變體遺傳資源，而且也為全面深入解析葉綠體發(fā)育的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

玉米永久性失綠突變體chs10、玉米自交系Mo17和齊319。其中chs10是利用60Co-γ射線處理玉米自交系齊319的種子所獲得。以玉米自交系Mo17為母本、chs10為父本所組配的F2分離群體，用于基因定位。

1.2 突變體chs10的表型鑒定及遺傳分析

對突變體chs10和野生型齊319進行多年多點田間種植觀察，鑒定突變表型和遺傳穩(wěn)定性。2020年在云南景洪、2021年在四川崇州試驗基地連續(xù)種植[Mo17 ×chs10] F2分離群體，并對F2分離群體中正常植株和失綠植株的分離比進行統(tǒng)計。

1.3 葉綠素含量測定

取野生型齊319和突變體chs10出現(xiàn)表型前后不同時期的葉片，每個時期取3個生物學(xué)重復(fù)，分別測定其葉綠素含量。去除葉片的中脈，并將其剪成細小片段，稱重0.1 g后放入10 mL的離心管內(nèi)，向管中倒入80%的丙酮抽提劑，放置于避光條件下24 h，確保葉片褪色后，分別在663、645和470 nm波長條件下測定提取液的吸光值，利用Arnon的方法計算光合色素中各成分含量，通過T檢驗來評估野生型和突變體在不同生長階段葉綠素含量的差異顯著性，統(tǒng)計結(jié)果若得出P<0.05，則有統(tǒng)計學(xué)差異；若P<0.01，則有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；若P<0.001，則有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

1.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

選取突變體chs10與野生型齊319 V3后期的第2片葉，將其固定于2.5%戊二醛電鏡固定液中。樣品交由成都里來生物科技有限公司進行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.5 基因定位

利用CTAB法提取玉米自交系Mo17、突變體chs10、野生型齊319和所組配的[Mo17 ×chs10] F2群體中各單株的DNA。使用本課題組前期合成的覆蓋玉米全基因組的1 050對SSR標記，對Mo17和chs10進行多態(tài)性引物分析。通過集群分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）篩選可能與目標基因連鎖的分子標記，即隨機選取F2定位群體的10株正常表型植株提取葉片的DNA，將其稀釋到一定的濃度后按等分量進行混合，形成一個正常池。同時選取10株突變表型植株提取葉片的DNA，稀釋成相同濃度并等分量混合為1個突變池，使用已鑒定出的多態(tài)性引物對雙親、F1、正常池和突變池進行基因型分析，篩選正常池與野生型或F1帶型相同，突變池與突變體帶型相同的具有穩(wěn)定性差異的多態(tài)性標記，并利用上述標記對F2群體內(nèi)突變表型單株進行基因分型，篩選與突變表型連鎖的多態(tài)性標記，對目標基因進行初步定位。之后，通過加大定位群體，在初定位區(qū)間的基礎(chǔ)上不斷開發(fā)新的分子標記，對目的基因進行精細定位。

1.6 候選基因的預(yù)測及分析

基于玉米的參考基因組序列，預(yù)測精細定位區(qū)間內(nèi)的候選基因。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）網(wǎng)站上，獲取精細定位區(qū)間內(nèi)基因的序列和注釋信息，利用NCBI在線引物設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計引物，以野生型齊319和突變體chs10的葉片cDNA為模板，擴增候選基因的CDS序列。將PCR產(chǎn)物送往有康生物科技有限公司進行測序并利用SnapGene進行序列比對，明確關(guān)鍵候選基因，確定變異位點。

1.7 關(guān)鍵候選基因的qRT-PCR分析

取野生型齊319和突變體chs10不同生長階段的不同組織，每組樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，利用Trizol法提取樣品RNA，完成抽提后進行RNA的純化及反轉(zhuǎn)錄，用瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質(zhì)量，利用NCBI-primer引物設(shè)計工具設(shè)計候選基因的qRTPCR引物，以Actin為對照進行qRT-PCR擴增反應(yīng)。

1.8 亞細胞定位

以齊319和突變體chs10的葉片cDNA為模板，設(shè)計帶有PCAMBIA2300-eGFP載體同源臂的引物，通過PCR擴增目的基因的全長CDS序列（除去終止密碼子）。利用同源重組的方法將酶切成功的pCAMBIA2300-35S-eGFP載體和目的片段連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽性克隆檢測并測序比對，挑選正確序列的單克隆擴繁，提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌，28 ℃，200 r/min過夜擴繁至OD600=0.6左右，5 000 r/min離心15 min收集菌體，棄上清，用煙草注射緩沖液重懸菌體。將4～5周齡的煙草在日光燈下照射2～3 h，以此促使葉片的氣孔完全敞開，用去掉針頭的1 mL注射器吸取菌液，注射到煙草下表皮無葉脈的位置，待菌液在葉片背面充分蔓延后，用筆勾勒出菌液擴散的輪廓。2至3 d后，通過激光共聚焦顯微鏡對這些被標記區(qū)域的熒光信號進行檢測（葉綠體熒光信號激發(fā)波長640 nm，發(fā)射波長675 nm；綠色熒光蛋白GFP激發(fā)光488 nm，發(fā)射光510 nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體chs10的表型鑒定及葉綠素含量分析

玉米失綠突變體chs10選自自交系齊319誘變處理后代。將chs10自交得到純合種子，通過多年多點田間種植觀察，發(fā)現(xiàn)生長至V1時期的chs10與野生型齊319相比無明顯葉色差異，但葉尖處出現(xiàn)白色斑點（圖1A-B），待突變體chs10生長至V2時期，可觀察到植株幼苗最下部葉片開始失綠（圖1C-D），V5時期植株基部葉片變黃更為明顯（圖1-E），隨著植株生長發(fā)育推進，葉鞘、葉環(huán)、莖稈、苞葉、雄小穗均呈黃化狀態(tài)（圖1F-J）。自V2時期開始，植株葉片從底部到頂部、由葉尖至葉基部逐漸由綠轉(zhuǎn)黃且后期不再復(fù)綠。前期研究結(jié)果顯示chs10與野生型齊319的單株產(chǎn)量無顯著差異（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

圖1 野生型齊319和突變體chs10的性狀比較Figure 1 Comparison of characters between wild type Qi319 and mutant chs10

對野生型和突變體不同生長時期的第2片葉的光合色素含量進行比較（表1），發(fā)現(xiàn)在V1時期即突變表型出現(xiàn)前，突變體chs10與野生型齊319的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均無明顯差異（圖2-A）；在失綠表型開始出現(xiàn)的V2時期，chs10的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別比野生型下降55%、48.6%、67.9%和46.2%，差異均達極顯著水平（圖2-B）；后期的植株生長一直伴隨著突變體基部葉片顏色的改變，chs10葉片的各葉綠素含量持續(xù)下降（圖2C-D），直至V5時期，chs10第二葉的各葉綠素含量趨近于零，失綠表型更為明顯（圖2-E）。

表1 野生型齊319和突變體chs10不同時期第2葉的葉綠素含量Table 1 Chlorophyll content in the second leaf of wild-type Qi 319 and mutant chs10 at different stages

圖2 野生型齊319和突變體chs10不同時期第2葉的光合色素含量Figure 2 Photosynthetic pigment content in the second leaf of wild-type Qi 319 and mutant chs10 at different stages

2.2 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

為了更深入地研究突變體chs10的失綠表型是否與葉綠體發(fā)育相關(guān)，對野生型和突變體V3時期第二葉的葉綠體結(jié)構(gòu)進行觀察。結(jié)果顯示，野生型葉綠體基質(zhì)濃厚，且內(nèi)部的類囊體基粒片層結(jié)構(gòu)清晰，可正常垛疊，排列規(guī)則有序（圖3A-B）；而突變體的葉綠體形態(tài)發(fā)生改變，體積變小，類囊體結(jié)構(gòu)紊亂，基粒片層垛疊數(shù)目與野生型相比急劇減少（圖3C-D），說明突變體chs10的葉綠體發(fā)育異常。

圖3 野生型齊319和突變體chs10的葉肉細胞透射電鏡圖Figure 3 Transmission electron microscopy of mesophyll cells of wild type Qi 319 and mutant chs10

2.3 突變體的遺傳分析與基因定位

將突變體chs10與Mo17組配F1代植株，F(xiàn)1代植株表型正常，F(xiàn)1代植株自交后的F2代群體中出現(xiàn)了明顯的性狀分離現(xiàn)象，對F2代分離群體中正常植株與失綠植株進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)F2群體中正常植株（+/+和chs10/+）與失綠植株（chs10/chs10）兩種表型的分離比符合3∶1（表2），遺傳分析結(jié)果表明該失綠突變表型是受單個隱性核基因控制。

利用課題組前期合成的覆蓋玉米全基因組的1050對SSR標記對chs10、Mo17，以及其組配的F1進行多態(tài)性檢測，共篩選到231對多態(tài)性分子標記。隨機選取[Mo17×chs10]F2分離群體中的10株正常表型單株和10株突變表型單株，分別組成正常池和突變池，利用篩選到的多態(tài)性標記對正常池和突變池進行BSA混池分析，篩選與chs10突變表型可能連鎖的分子標記，結(jié)果顯示在10號染色體上篩選出3對具有多態(tài)性的共顯性標記，即bnlg1655、umc2163、umc1045在正常池和突變池之間具有多態(tài)性。隨機挑選F2定位群體中的70株失綠表型突變單株進行驗證，結(jié)果顯示標記bnlg1655處的交換單株為10個、umc2163處的交換單株為8個、umc1045處的交換單株為6個，初步將目的基因定位于玉米第10號染色體。繼續(xù)開發(fā)新的InDel標記并進行多態(tài)性篩選（表3），進一步將突變位點定位于第10號染色體InDel 6和InDel 7之間，物理距離為9.85 Mb（圖4-A）。通過[Mo17×chs10]F2分離群體中798個突變表型單株和5個新開發(fā)的InDel多態(tài)性標記（表3），將目的基因定位在InDel 8和InDel 12之間約0.62 Mb的物理距離內(nèi)（圖4-B）。進一步加大定位群體，利用1 280個F2失綠表型單株和4個新設(shè)計的SNP多態(tài)性標記（表3），最終將目的基因定位在SNP-2和SNP-3之間約0.17 Mb的物理區(qū)間內(nèi)（圖4-C）。

圖4 突變體chs10的精細定位Figure 4 Fine mapping of chs10 mutant

2.4 候選基因預(yù)測及分析

在前述約0.17 Mb的精細定位區(qū)間內(nèi)，參考B73_V4版本基因組共有7個候選基因（表4）。以野生型齊319和突變體chs10的葉片cDNA為模板，擴增各候選基因的CDS序列并測序比對發(fā)現(xiàn)，Zm00001d025860基因在chs10突變體中第五外顯子的第45位堿基G缺失（圖5-A），由原來的賴氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，擴增引物為F: ATGGAGCTGG GAAAGCCCC/R: TTACTTATCGTCATCGTCTTTGTA ATCA，而其他6個基因的CDS序列在突變體和野生型中未檢測到差異。于是以Zm00001d025860基因的差異位點設(shè)計特異性SNP引物（F: TCCGTGATGTG GAGGATGAGG/R: GAGTTGTGGCGACGTAGTAGA），以在[Mo17×chs10]F2群體中檢測到的10個重組交換單株葉片DNA為模板，進行PCR擴增并測序，比對后發(fā)現(xiàn)10個重組交換單株在該位點都存在一個G堿基缺失（圖5-B），說明該突變位點可能與突變表型共分離。因此推測Zm00001d025860基因的突變最有可能導(dǎo)致chs10表型的產(chǎn)生。

表4 候選基因功能注釋Table 4 Functional annotation of candidate genes

圖5 變異位點分析和群體變異位點驗證Figure 5 Analysis of variation loci and validation of population variation loci

于是，設(shè)計Zm00001d025860基因的定量引物（F: GCCGCTTCTGGAAGGAATCT/R: TTCTGAATCC GCTGCCGTAG），檢測該基因在野生型齊319不同生長階段和不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示，Zm00001d025860基因在玉米根、莖、葉、葉鞘中均有表達，但在葉片中的表達量最高（圖6-A），這可能歸因于葉片是主要的光合器官。同時也檢測了Zm00001d025860在野生型齊319和突變體chs10不同發(fā)育階段的第二葉中的表達情況，結(jié)果顯示，該基因在突變體chs10中的表達量極顯著低于野生型齊319（圖6-B）。因此，將Zm00001d025860基因確定為chs10的關(guān)鍵候選基因。

圖6 Zm00001d025860的組織表達分析Figure 6 Tissue expression analysis of Zm00001d025860

2.5 Zm00001d025860蛋白預(yù)測及亞細胞定位

Zm00001d025860基因全長2 872 bp，由9段外顯子和8段內(nèi)含子組成（圖7-A），編碼一個由375個氨基酸組成的蛋白，具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域，突變后會導(dǎo)致4個跨膜結(jié)構(gòu)域丟失。利用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)突變體chs10中Zm00001d025860基因1 bp的堿基缺失嚴重影響了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，改變了蛋白質(zhì)的疏水特性。通過蛋白序列比對及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)（圖7-B），Zm00001d025860蛋白與高粱中的SORBI_3006G147300蛋白具有較高的同源性，但基因功能未知。Zm00001d025860在擬南芥中的同源基因（AT2G35260與AT4G17840）以及在番茄中的同源基因（Solyc08g00510）均已報道與葉綠素代謝平衡相關(guān)[1,6]，結(jié)合本研究中突變體chs10的葉色表現(xiàn)，我們推測Zm00001d025860可能參與葉綠素代謝調(diào)控。

圖7 基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)進化分析Figure 7 Gene structure and protein evolution analysis

利用STRING預(yù)測到GRMZM2G464328與目的基因Zm00001d025860具有潛在的互作關(guān)系（圖8-A），Zm00001d025860在擬南芥中的同源基因為BALANCE OF CHLOROPHYLL METABOLISM 1(BCM1)和BALANCE OF CHLOROPHYLL METABOLISM 2(BCM2)，這2種BCM蛋白均參與葉綠素生物合成過程的調(diào)控，GRMZM2G464328在擬南芥中的同源基因為GENOMES UNCOUPLED 4(GUN4)，GUN4是一種四吡咯信號分子，也是葉綠素積累所必需的。并且，已有研究證實擬南芥中BCM1與GUN4之間存在真實的互作關(guān)系。于是我們將構(gòu)建的含有CaMv 35S啟動子的Zm00001d025860-eGFP和GRMZM2G 464328-eGFP載體轉(zhuǎn)化到煙草葉片表皮中進行瞬時表達，40 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果顯示，Zm00001d025860蛋白定位在細胞膜和葉綠體；GRMZM2G464328與目的基因共同定位于細胞膜（圖8-B），暗示兩者可能存在互作。

圖8 Zm00001d025860潛在互作蛋白的預(yù)測以及亞細胞定位結(jié)果Figure 8 Prediction and subcellular localization of potential interacting proteins in Zm00001d025860

3 討論

玉米中已報道的葉色突變體有很多，elm1突變表型為中胚軸伸長，幼苗葉片及節(jié)間呈淡綠色，該突變基因定位于玉米的8號染色體[17]；ygl-1突變體葉片呈現(xiàn)黃綠色，突變基因定位于1號染色體[12]，nec-t黃化類病變突變體苗期葉片呈現(xiàn)黃綠色并伴有壞死斑，后期會逐漸萎蔫死亡，突變基因定位于2號染色體[18]，vy1黃葉突變基因位于9號染色體[19]。而本研究所發(fā)現(xiàn)的突變體chs10與已報道的其他葉色突變體不同，控制chs10突變表型的基因被定位在10號染色體，chs10自V2時期開始葉片從幼苗基部到頂部逐漸由綠轉(zhuǎn)黃，莖稈、葉鞘、苞葉、雄穗等組織也會隨著植株生長始終保持黃化狀態(tài)，并且其產(chǎn)量沒有受到影響。因此，永久性失綠突變體chs10的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了玉米的基因資源以及突變體類型，還可作為深入研究葉綠體發(fā)育及葉綠素合成的寶貴材料。

葉綠素的穩(wěn)態(tài)水平是由葉綠素合成代謝和分解代謝的相對速率決定[20]，chs10的葉綠素含量顯著降低，推測是由于Zm00001d025860基因突變導(dǎo)致葉綠素合成受阻，從而造成葉片以及其他器官表型的變化。葉綠素（Chl）是由四吡咯途徑的鎂分支所合成，其中5-氨基乙酰丙酸（ALA）的合成和鎂離子螯合酶（MgCh）是調(diào)控葉綠素合成的2個關(guān)鍵限速步驟[21]。首先，谷氨酰-tRNA（Glu-tRNA）經(jīng)過反應(yīng)形成帶有不完整碳環(huán)結(jié)構(gòu)的ALA[22]，通過6個酶促反應(yīng)將ALA轉(zhuǎn)化為原卟啉Ⅸ（Proto Ⅸ），它是葉綠素和血紅素的共同前體，在Proto Ⅸ處有2條分支，一條是合成血紅素的鐵分支，另一條是形成葉綠素的鎂分支。MgCh是一個由多個亞單位CHLH、CHLI和CHLD組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)復(fù)合體[23-24]，它促進Mg2+與Proto Ⅸ結(jié)合，形成鎂-原卟啉Ⅸ（Mg-Proto Ⅸ），隨后被還原形成葉綠素酯，通過進一步的加工修飾形成葉綠素a以及葉綠素b[25]。GUN4是一種卟啉結(jié)合蛋白，參與葉綠素生物合成調(diào)節(jié)和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)[26]，它可以直接與MgCh的催化亞基CHLH相互作用，提高MgCh的活性并結(jié)合其底物（Proto Ⅸ）和螯合反應(yīng)的產(chǎn)物（Mg-Proto Ⅸ），從而參與到葉綠素的合成調(diào)控過程[27-28]。利用STRING預(yù)測到GRMZM2 G464328與目的基因Zm00001d025860具有潛在的互作關(guān)系，并且亞細胞定位結(jié)果也暗示兩者可能存在互作，GRMZM2G464328是玉米中GUN4的同源基因，在葉綠素合成途徑中，GUN4與MgCh存在正反饋調(diào)節(jié)，Zm00001d025860突變后可能會影響與GRMZM2G464328的互作，從而使MgCh的活性以及MgCh催化亞基的穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致葉綠素合成的前體物質(zhì)減少，葉綠素形成受阻。或者MgCh的活性降低，使Proto Ⅸ在葉綠素與血紅素的合成途徑中分配比例發(fā)生改變，進而血紅素含量升高，引起突變體葉色改變[29-30]。所以，我們猜測ZmCHS10可能與GUN4互作共同作為激活MgCh的輔因子并參與葉綠素合成。突變體chs10最明顯的表型特征是從下部葉向上部葉逐漸失綠，葉尖和葉片邊緣的顏色首先褪色，從綠色變?yōu)榈S色，并逐漸向葉片基部擴展，這是植物缺鎂時典型的癥狀。因此，我們認為Zm00001d025860突變后可能通過影響與GRMZM2G464328的互作來降低MgCh的活性，使其催化Mg2+的能力下降。來自UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的信息顯示Zm00001d025860參與金屬內(nèi)肽酶活性的調(diào)節(jié)，而Mg2+含量降低可能會抑制金屬內(nèi)肽酶的活性，使蛋白水解受阻，從而影響植物正常生長。并且鎂也是產(chǎn)生葉綠素所必需的營養(yǎng)元素，因此我們推測，chs10突變表型的出現(xiàn)可能與鎂的利用率降低有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究鑒定了一份新的玉米永久性失綠突變體chs10、chs10苗期葉片開始變黃，后期葉鞘、葉環(huán)、莖稈、苞葉和雄穗也均為黃色并不再復(fù)綠，突變表型受一對隱性核基因控制，該基因被定位于玉米10號染色體長臂標記SNP-2和SNP-3之間約0.17 Mb范圍內(nèi)，并確定了其關(guān)鍵候選基因Zm00001d025860。測序發(fā)現(xiàn)Zm00001d025860的第五外顯子的第45位堿基G缺失，使終止密碼子提前出現(xiàn)，蛋白翻譯提前終止，從而導(dǎo)致4個跨膜結(jié)構(gòu)域的丟失，致使編碼蛋白的疏水性功能發(fā)生變化。Zm00001d025860在玉米葉片中高表達，但該基因功能未知，在擬南芥和番茄中的同源基因均被報道與葉綠素代謝平衡相關(guān)。此外，CHS10蛋白定位在細胞膜和葉綠體。chs10突變體的發(fā)現(xiàn)為解析葉綠素合成與葉片顏色變化之間的分子機制提供了新的遺傳材料，后續(xù)將進一步探索該基因影響葉綠體發(fā)育和導(dǎo)致葉綠素含量降低的機制。