王輝靈，韓會玲*，王曉晗，焦鎮(zhèn)，李步陽，何彎彎，2，孫偉明，2*

（1.河北科技師范學(xué)院海洋資源與環(huán)境學(xué)院/農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室（籌），河北 秦皇島 066000；2.河北長生果肥料研究院有限公司，河北 衡水 053000）

花生是我國主要油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，花生產(chǎn)業(yè)強(qiáng)勢有力的發(fā)展對我國油料產(chǎn)業(yè)安全具有重要意義?；ㄉ∈墙陙韽V泛突發(fā)于我國北方花生主要種植區(qū)的一種土傳病害，循環(huán)侵染。該病害具有分布范圍廣、危害重、難防治等特點，可造成15%以上的減產(chǎn)甚至絕收，日益加重的病害已成為花生生產(chǎn)的巨大威脅。土傳病害嚴(yán)重影響作物健康，例如土生真菌尖孢鐮刀菌已報道的可侵染100多種不同作物，導(dǎo)致植物的維管束枯萎和死亡[1]。水稻惡苗病相關(guān)的真菌為鐮刀菌，能引起黃化癥狀，導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低，植株異常高大虛弱，從而導(dǎo)致植物死亡[2]。不同的植株上的輪紋病菌會引起不同的癥狀，例如大豆紅冠腐病和花生黑腐病[3]。本課題組前期對河北省花生主產(chǎn)區(qū)花生果腐病的病原菌進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明，新孢鐮刀菌(F.neocosmosporiellum)是河北省花生的主要產(chǎn)區(qū)發(fā)生花生果腐病的主要致病菌[4]。

分泌蛋白（secreted proteins）是蛋白組的一個重要組成部分。在細(xì)胞內(nèi)合成，由信號肽引導(dǎo)分泌到胞外行使功能，通過位于分泌蛋白N端的信號肽，在相應(yīng)前體蛋白的胞外轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用[5]。近年來在病原與寄主互作研究中，關(guān)于病原菌分泌蛋白功能的研究越來越受到重視，病原菌的分泌蛋白在與寄主抗性蛋白的互作已有研究表明[6]、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡、個體發(fā)育等生理生化過程中占有關(guān)鍵位置，尤其是在病原菌致病性等方面起重要作用[7]。分泌蛋白很多研究表明其是多種真菌通過操縱宿主進(jìn)行有效定殖而致病的關(guān)鍵[8]。病原真菌與寄主互作的毒力因子多為其分泌的多種分類為細(xì)胞壁降解酶的酶類，例如多聚半乳糖醛酸酶、酯酶、果膠裂解酶和木聚糖酶等，這些毒力因子可攻擊植物細(xì)胞的細(xì)胞壁、抑制或者阻礙植株的抗性反應(yīng)、降解植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的碳氮化合物以獲取植物營養(yǎng)及參與病原菌的定殖等[7]。

效應(yīng)子是病原菌在侵染植物過程中會分泌的一類具有抑制寄主的先天免疫反應(yīng)、增強(qiáng)病原菌在寄主的體內(nèi)寄生感染能力的一類蛋白質(zhì)[9]，在植物與其病原菌的互作過程中有重要作用[10]。研究表明，多種植物病原菌均能將效應(yīng)子輸出到宿主細(xì)胞內(nèi)部[11]。病原菌成功定殖需要效應(yīng)子首先對宿主進(jìn)行有效的操控[12]。大部分植物病原體效應(yīng)子為分泌蛋白[13]，其可被分泌到質(zhì)外體、植物質(zhì)膜外或者宿主細(xì)胞內(nèi)[14]。在尖孢鐮刀菌的研究中，寄主專一性可以部分地由效應(yīng)子決定[15]。效應(yīng)子以多種方式作用于不同的靶標(biāo)，抑制植物免疫、操縱植物生理并被寄主防御機(jī)制識別，從而促進(jìn)病原菌的侵染、擴(kuò)張與定殖[16]。

隨著更多的病原真菌全基因組測序的完成，利用生物信息學(xué)的方法和手段從基因組的水平上對病原菌的基因組進(jìn)行分泌蛋白的預(yù)測與分析，已成為利用高通量技術(shù)手段篩選真菌的致病因子的極其重要的方法與技術(shù)手段。目前，已有學(xué)者進(jìn)行了病原真菌完整基因組分泌蛋白的預(yù)測和分析。邢啟凱等[5]預(yù)測并分析了可可毛色二孢基因組范圍內(nèi)的分泌蛋白，并明確其基本特征，為該病菌分泌蛋白致病機(jī)理的研究打下了基礎(chǔ)。董章勇等[17]對玫煙色棒束孢候選效應(yīng)因子進(jìn)行了全基因組的預(yù)測分析，最終從10 061個蛋白序列中篩選得到19個候選致病效應(yīng)因子。鑒于新孢鐮刀菌的致病機(jī)理目前還未見報道，本研究利用生物信息學(xué)手段對新孢鐮刀菌全基因組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，結(jié)合SignalP、TMHMM、WoLF PSORT、NetGPI、CalMolWt、eggnogmapper和EffectorP等軟件對其分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測及分析，為揭示該病原菌的侵染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料采集

花生果腐病的樣品于2018年9月17日采集自河北省黃河故道花生產(chǎn)區(qū)（河北南部邯鄲市大名縣）、沙河流域花生產(chǎn)區(qū)（河北中部新樂市）以及灤河流域花生產(chǎn)區(qū)（河北北部秦皇島市昌黎縣）。供試材料整株采集，取具有典型癥狀的發(fā)病莢果進(jìn)行病原菌分離。

1.2 花生果腐病病原菌分離和純化

在實驗室內(nèi)對病原菌進(jìn)行分離純化，按照常規(guī)組織分離法處理采集的樣品。取具有典型癥狀的發(fā)病莢果，75%乙醇消毒60 s，滅菌水沖洗并吸干表面水分，0.1%升汞消毒30 s，滅菌水沖洗4次并吸干表面水分。進(jìn)行表面消毒后，用滅菌后的手術(shù)刀切取花生的病健交界處的組織10～15 mm2，接于含100 μg/mL鏈霉素的PDA平板上，于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，長出菌落后，挑取菌落尖端的少量菌絲接種于新的含100 μg/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得單一菌株。分離出的菌種結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子鑒定結(jié)果，依據(jù)最新的分類學(xué)研究成果[18]，確定本次分離的花生果腐病的優(yōu)勢病原菌為F.neocosmosporiellum（曾用名N.vasinfecta）。新孢鐮刀菌菌株XL-3-5由河北科技師范學(xué)院微生物與食用菌實驗室分離和保存。

1.3 生物信息學(xué)分析

將菌株進(jìn)行全基因組測序，基因組序列及推測蛋白的氨基酸組成序列。由武漢希望組生物科技有限公司測序，質(zhì)量完好的菌株XL-3-5基因組分別通過Pacbio Sequel系列測序儀進(jìn)行單分子實時熒光三代測序和Illumina NovaSeq6000平臺進(jìn)行二代高通量測序，同時利用高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

采用全基因組鳥槍法（WGS）的策略，首先利用第二代測序技術(shù)去構(gòu)建二代小片段的DNA文庫，再在MGI上對片段兩端進(jìn)行雙末端（paired-end）測序、然后通過組裝得到初始基因組，結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)（三代、二代）進(jìn)行基因組堿基校正獲得高準(zhǔn)確率的基因組。基于前期對基因組背景的了解進(jìn)行去污染和去冗余分析，最后對基因組進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量評估。

1.3.1 新孢鐮刀菌全基因組蛋白N-端信號肽預(yù)測

利用SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)對全基因組氨基酸序列中是否存在信號肽切割位點及其具體位置進(jìn)行預(yù)測。應(yīng)分泌蛋白具有能引導(dǎo)穿過細(xì)胞膜被運輸?shù)竭_(dá)胞外的信號肽且其位于分泌蛋白的N端，所以對蛋白質(zhì)是否具有N-端信號肽進(jìn)行預(yù)測。當(dāng)D-score≥0.5時，蛋白質(zhì)具有N-端信號肽[19]。

1.3.2 新孢鐮刀菌分泌型蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

將含有信號肽的新孢鐮刀菌全蛋白序列，利用蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示膜內(nèi)氨基酸螺旋的預(yù)期數(shù)量大于18，則很大概率是跨膜蛋白（或者具有信號肽）。含有跨膜區(qū)的分泌型信號肽蛋白可能是膜上的錨定蛋白或者離子通道蛋白，也可能為膜受體。

1.3.3 新孢鐮刀菌蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測

在線預(yù)測軟件WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位，對含有信號肽且無跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。進(jìn)而對真核蛋白序列在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布與位置進(jìn)行預(yù)測。

1.3.4 新孢鐮刀菌分泌型蛋白的錨定位點預(yù)測

對新孢鐮刀菌全蛋白序列中通過以上預(yù)測并符合其特征蛋白序列，用NetGPI-1.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetGPI-1.1/）進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測。NetGPI-1.1用于鑒定蛋白質(zhì)的GPI-錨定位點，預(yù)測其是否會錨定在細(xì)胞膜上，而分泌蛋白無GPI-錨定位點，不能錨定在細(xì)胞膜上。

1.3.5 新孢鐮刀菌分泌蛋白氨基酸數(shù)量統(tǒng)計

對新孢鐮刀菌全蛋白組序列中，經(jīng)過分泌蛋白預(yù)測的序列進(jìn)行氨基酸數(shù)量統(tǒng)計。使用CalMolWt(http：//www.tofms.org/CalMW/MYMWele.asp)分析蛋白序列的數(shù)量特點及氨基酸組成特點。

1.3.6 新孢鐮刀菌分泌蛋白組的功能注釋

利用數(shù)據(jù)庫eggnog-mapper（http：//eggnogmapper.embl.de/job_status?jobname=MM_5yteeznr）對新孢鐮刀菌中預(yù)測的分泌蛋白組進(jìn)行功能分析，經(jīng)過比對預(yù)測其功能。并通過COG（蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫比對并對功能進(jìn)行功能注釋及分類。

1.3.7 新孢鐮刀菌分泌蛋白組中效應(yīng)蛋白的預(yù)測和功能分析

對潛在的效應(yīng)蛋白進(jìn)行預(yù)測需要使用效應(yīng)蛋白的預(yù)測網(wǎng)頁EffectorP 3.0（https：//effectorp.csiro.au/index.html）進(jìn)行預(yù)測和功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新孢鐮刀菌蛋白的N-端信號肽的預(yù)測

利用網(wǎng)頁SignalP 5.0服務(wù)器預(yù)測信號肽及其在真核蛋白質(zhì)中的切割位點。新孢鐮刀菌的全基因組共編碼12 756條蛋白序列，SignalP 5.0服務(wù)器分析結(jié)果表明該菌含有N-端信號肽的蛋白共1 169條序列，其在總蛋白序列占比達(dá)9.15%。信號肽可引導(dǎo)這些蛋白進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中[20]。

2.2 新孢鐮刀菌分泌型蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測軟件TMHMM-2.0分析上述具有信號肽序列的蛋白，結(jié)果表明：在上述1 169條有信號肽的蛋白中，共預(yù)測出250條蛋白序列具跨膜區(qū)。推測出這些蛋白屬于細(xì)胞膜錨定蛋白、細(xì)胞膜受體蛋白或細(xì)胞離子通道蛋白，不會分泌到膜外。其余的919條蛋白沒有該跨膜結(jié)構(gòu)域，這一特征屬于分泌蛋白的典型特征[21]。

2.3 新孢鐮刀菌全基因組具有信號肽的蛋白亞細(xì)胞定位

將新孢鐮刀菌全基因蛋白序列中含有信號肽且無跨膜結(jié)構(gòu)域的919條蛋白序列，使用WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)分析發(fā)現(xiàn)：其中屬于細(xì)胞外分泌型的有808條蛋白序列，而其余111條（圖1）蛋白分別被轉(zhuǎn)運到線粒體（41條）、細(xì)胞質(zhì)（31條）、過氧物酶體（14條）、細(xì)胞核（12條）、質(zhì)膜（11條）、高爾基體（1條）和細(xì)胞骨架（1條）。

圖1 蛋白亞細(xì)胞定位Figure 1 Protein subcellular localization

2.4 新孢鐮刀菌分泌型蛋白的錨定位點預(yù)測

能夠通過GPI錨定位點而在質(zhì)膜上錨定的這部分蛋白需要在預(yù)測分泌蛋白時篩選掉。利用Net-GPI-1.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetGPI-1.1/)對可進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，將分類為胞外分泌型的并且預(yù)測為無跨膜結(jié)構(gòu)域的808條蛋白序列進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明含有GPI錨定位點的有107條蛋白序列不符合經(jīng)典的分泌蛋白特征，其余701條分泌型蛋白序列符合經(jīng)典的分泌蛋白特征，故將其認(rèn)定為新孢鐮刀菌的分泌蛋白組。

2.5 新孢鐮刀菌分泌蛋白組的特征分析

2.5.1 新孢鐮刀菌分泌蛋白組的氨基酸長度分析

分析新孢鐮刀菌分泌蛋白組的序列長度，結(jié)果表明新孢鐮刀菌分泌蛋白長度分布跨度較大，其中蛋白的氨基酸長度主要分布在101～700個范圍內(nèi)，共有623條序列，在序列總數(shù)的占比為88.87%。數(shù)量排前三名的分別是氨基酸長度為301～400的蛋白序列，占預(yù)測到的經(jīng)典分泌蛋白總數(shù)的20.11%；201～300個氨基酸長度18.83%；和101～200個氨基酸長度，占15.70%（圖2）。

圖2 氨基酸長度分析Figure 2 Amino acid length analysis

2.5.2 新孢鐮刀菌分泌蛋白組的氨基酸組成分析

對該菌預(yù)測分泌蛋白的氨基酸組成成分進(jìn)行含量分析，結(jié)果顯示，常見20種氨基酸在新孢鐮刀菌分泌蛋白中的含量差異顯著。由高到低依次為：A（丙氨酸）、G（甘氨酸）、S（絲氨酸）、L（亮氨酸）、T（蘇氨酸）、V（纈氨酸）、D（天冬氨酸）、P（脯氨酸）、E（谷氨酸）、K（賴氨酸）、N（天冬酰胺）、I（異亮氨酸）、F（苯丙氨酸）、R（精氨酸）、Y（酪氨酸）、Q（谷氨酰胺）、H（組氨酸）、W（色氨酸）、C（半胱氨酸）和M（甲硫氨酸），其中疏水非極性的氨基酸（A、G、L、V、P和I）含量（41.93%）明顯高于親水極性的氨基酸（S、T、N、Q、M和C）含量（26.82%）。酸性氨基酸（A和E）的含量為14.12%，堿性氨基酸（K、R、H）的含量為10.55%，芳香族氨基酸（F、Y和W）的含量僅為9.38%（圖3）。

圖3 氨基酸組成分析Figure 3 Amino acid composition analysis

2.6 新孢鐮刀菌分泌蛋白組信號肽切割位點分析

通過對新孢鐮刀菌分泌蛋白組信號肽切割位點-3到+2的位點進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示在-3、-2、-1、+1和+2位點出現(xiàn)的頻率最高的氨基酸分別為A、S、A、A和P，其所占的百分率分別為51.2%、20.4%、80.9%、25.0%和32.8%（表1）。在-3位，除A之外出現(xiàn)較多的氨基酸殘基為V（25.1%）和S（9.1%），而氨基酸D、E、K、F、R、Q、H、W和M未發(fā)現(xiàn)被使用。在切割位點（-1位），除A之外出現(xiàn)較多的氨基酸為G（10.5%）和S（4.1%），氨基酸L、D、E、N、F、R、Y、H、W和M則未見出現(xiàn)。在-2位點，所有的氨基酸均有使用。在+1位點，除P外的所有氨基酸均有使用。在+2位點所有種類的氨基酸均被使用。以上結(jié)果表明，新孢鐮刀菌預(yù)測到的分泌蛋白信號肽切割位點-3和-1位置上的氨基酸相對保守，是信號肽酶的關(guān)鍵識別位點。預(yù)測到的分泌蛋白組信號肽的切割位點-3到-1的氨基酸為A-S-A，屬于A-X-A型，為真核生物中典型SP Ⅰ型信號肽酶所識別的信號肽切割位點。

表1 信號肽切割位點Table 1 The signal peptidase cleavage sites position

2.7 新孢鐮刀菌分泌蛋白組的COG功能注釋

利用eggnog-mapper數(shù)據(jù)庫對新孢鐮刀菌預(yù)測到的分泌蛋白組中的701條序列進(jìn)行功能分析，共有656條序列可以注釋到完整的功能。通過COG數(shù)據(jù)庫對其功能進(jìn)行分類，除去未分類的143條未知蛋白序列，將新孢鐮刀菌的分泌蛋白分為：第1種S類，即功能未知類，共有序列162個，如：芳基硫酸酯（Arylsulfotran 2）、S1-P1核酸酶（S1-P1 nuclease）、β-內(nèi)酰胺酶（beta-lactamase）等功能未知蛋白；第2種G類，碳水化合物的運輸和代謝蛋白，序列數(shù)為140個，如：硫酸酯酶（sulfatase）、果膠酸裂解酶（pectate lyase）、β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase）、纖維素酶（cellulase）等；第3種O類，即蛋白翻譯后修飾和分子伴侶，序列數(shù)為102個，如：肽酶二聚結(jié)構(gòu)域（peptidase dimerisation domain）、肽酶S10（peptidase S10）等；第4種E類為26個；第5種C類（22個）；第6種Q類（預(yù)測到15個）。分泌蛋白在其余的功能分類數(shù)目則相對較少（圖4）。

圖4 分泌蛋白功能分類Figure 4 Functional classification of secretory proteins

2.8 新孢鐮刀菌分泌蛋白組中效應(yīng)蛋白的預(yù)測和功能分析

將符合條件的序列進(jìn)行下一步篩選。篩選分泌蛋白的蛋白序列長度，去除大于300個氨基酸的蛋白序列[22]，繼而通過EffectorP 3.0預(yù)測潛在效應(yīng)蛋白，結(jié)果表明預(yù)測到的效應(yīng)蛋白序列為162條，占分泌蛋白總數(shù)的23.10%。其中質(zhì)外體效應(yīng)蛋白有89條，細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白有40條，另外33條既是質(zhì)外體效應(yīng)蛋白也是細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白。質(zhì)外體效應(yīng)蛋白為胞間效應(yīng)蛋白，積累于植物細(xì)胞間隙，被分泌到胞外空間，并通過與胞間靶蛋白或細(xì)胞膜受體相結(jié)合來發(fā)生作用[23]。細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白被已知或未知的轉(zhuǎn)運機(jī)制到植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)位于植物的不同亞細(xì)胞區(qū)域[23]。也就是說，它們要么留在細(xì)胞內(nèi)，要么在分泌后重新進(jìn)入胞漿[24]。

上述被預(yù)測為效應(yīng)蛋白的162條序列中的69條序列可以在eggnog-map數(shù)據(jù)庫中比對出結(jié)果，并有54條序列注釋到具體功能。在COG分類中，有4條序列分別為U（1條）、C（1條）和E（2條）。其余的50條序列中13條序列屬于G類（carbohydrate transport and metabolism），11條序列屬于O類（posttranslational modification，protein turnover，chaperones），26條序列則屬于S類（function unknown）。S類蛋白結(jié)構(gòu)域和功能未知的蛋白有真菌疏水蛋白（fungal hydrophobin）、壞死誘導(dǎo)蛋白（necrosis inducing protein，NPP1）和成束蛋白（fasciclin）等。

細(xì)胞壁的成分主要是纖維素和果膠，因此當(dāng)病原菌分泌果膠裂解酶時有利于其侵染莢果。選取部分預(yù)測為果膠裂解酶的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，在NCBI進(jìn)行Blastp比對，預(yù)測為果膠裂解酶的序列均與其他果膠裂解酶序列高度相似。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），發(fā)現(xiàn)contig000001.146和contig000004.533均為果膠裂解酶。和Candidatus Bathyarchaeota果膠裂解酶親緣關(guān)系最近。同樣的方法對contig000001.1756和contig000004.1110進(jìn)行序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。發(fā)現(xiàn)contig000001.1756和contig000004.1110均為β-半乳糖苷酶，和Ktedonobacteraceae bacteriumβ-半乳糖苷酶的相似度最高，親緣關(guān)系最近（圖6）。

圖5 contig000001.146 與contig000004.533系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 contigo00001.146 and contigo000004.533 phylogenetic trees

圖6 contig000001.1756與contig000004.1110系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 contig000001.1756與contig000004.1110 phylogenetic trees

3 討論

花生果腐病對花生產(chǎn)業(yè)的健康具有較嚴(yán)重的威脅，所以利用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析基因組，篩選相應(yīng)分泌蛋白對花生產(chǎn)業(yè)健康具有重要意義。隨著眾多植物病原真菌全基因組測序工作的完成，大量分泌蛋白和效應(yīng)蛋白報道為植物病原真菌的致病蛋白，因此開展基因組規(guī)模的分泌蛋白和效應(yīng)蛋白的預(yù)測和功能分析，對了解新孢鐮刀菌的侵染機(jī)制提供了堅實的理論基礎(chǔ)。

通過SignalP、TMHMM、WoLF PSORT和NetGPI等軟件的分析，本文首次對新孢鐮刀菌全基因組共12 756條蛋白序列進(jìn)行分析，預(yù)測到了新孢鐮刀菌分泌蛋白組的701條蛋白序列為經(jīng)典分泌蛋白，占其蛋白序列總條數(shù)的5.49%，與于欽亮等[25]預(yù)測到的禾谷鐮刀菌分泌蛋白（F.graminearum）（5.40%）、NIE Y.等[26]預(yù)測到的尖孢鐮刀菌甜瓜專化型分泌蛋白（F.oxysporum f.sp melonis）（5.40%）和何艷秋等[7]預(yù)測到的尖孢鐮刀菌古巴?；?號小種分泌蛋白（Fusarium oxysporumm f.sp.cubense race 1，F(xiàn)oc1）(6.40%)在全基因組蛋白序列中所占比例相似。植物病原真菌中分泌蛋白的數(shù)量占總蛋白質(zhì)數(shù)量的比例約為3.65%～9.58%[27]。分泌蛋白多以101～600個氨基酸的中小分子蛋白質(zhì)為主，中小分子的分泌蛋白結(jié)構(gòu)相對簡單，有利于其在病原菌與寄主植物的互作中發(fā)揮功能。

新孢鐮刀菌分泌蛋白的氨基酸組成中氨基酸殘基最多的為丙氨酸，非極性的疏水氨基酸含量（41.93%）明顯高于極性的親水氨基酸含量（26.82%），信號肽切割位點處氨基酸種類組成為A-S-A，屬于A-X-A型。以上結(jié)果與已報道的稻瘟菌[28]、鐮刀菌古巴專化型[7]、核桃細(xì)菌性黑斑病菌[29]等類似，進(jìn)一步印證了其分泌蛋白的屬性，更利于其穿透質(zhì)膜，運輸?shù)桨鈱崿F(xiàn)對寄主植物的侵染。

G類分泌蛋白能破壞植物-病原菌間的屏障——降解植物細(xì)胞壁，加快菌絲侵染[3]。對新孢鐮刀菌的701條經(jīng)典分泌蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測分析表明，有140條蛋白為參與碳水化合物運輸與代謝的酶類，在功能明確的蛋白中占21.3%。進(jìn)一步的效應(yīng)蛋白分析也表明，75.30%的效應(yīng)蛋白為質(zhì)外體效應(yīng)蛋白，有50條蛋白為GOS類蛋白，在功能明確的蛋白中占92.59%。表明新孢鐮刀菌作為土壤習(xí)居菌，擁有大量降解細(xì)胞壁的酶類，如纖維素酶、半乳糖苷酶、果膠裂解酶和UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等，有較強(qiáng)的寄生和腐生在寄主植物上的能力。

利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對全基因組進(jìn)行分析可以預(yù)測分泌蛋白，但相同的分泌蛋白在不同病原菌中是否具有同樣的功能，仍需進(jìn)一步的試驗分析和驗證。本研究通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，篩選的分泌蛋白均為生命活動中的重要蛋白，為今后利用分子生物學(xué)試驗開展該菌種的分泌蛋白組研究提供依據(jù)。為深入研究其致病方式以及其病源危害，接下來可對病原菌不同侵染時期的分泌蛋白進(jìn)行組學(xué)分析，同時對主要分泌蛋白進(jìn)行基因功能研究，也為進(jìn)一步研究新孢鐮刀菌對寄主植物致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過完成新孢鐮刀菌全基因組測序，利用生物信息學(xué)技術(shù)從基因組規(guī)模進(jìn)行了分泌蛋白的分析預(yù)測，得到了701個經(jīng)典分泌蛋白，其長度主要為101～700個氨基酸，主要由A、G、S和L等氨基酸組成。信號肽切割位點處氨基酸種類組成為A-S-A，屬于保守的A-X-A型。進(jìn)一步的功能和效應(yīng)蛋白預(yù)測表明，新孢鐮刀菌擁有大量的降解細(xì)胞壁的酶類，為致病蛋白的試驗分析奠定了基礎(chǔ)，為研究花生果腐病致病菌新孢鐮刀菌的分泌蛋白、致病因子、效應(yīng)蛋白及其與植物間的互作提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。其中，預(yù)測到纖維素酶、果膠裂解酶、半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等與其致病性相關(guān)的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的實驗，例如分泌蛋白的原核表達(dá)、基因功能驗證以及基因表達(dá)水平的檢測等，為后續(xù)新孢鐮刀菌致病機(jī)理研究提供進(jìn)一步支持。