吳敏, 馮偉珂, 占一姍, 王劍巧, 曾金娣, 李科浩, 張守華, 陶強(qiáng), 占敏△

1江西省兒童醫(yī)院普外科(江西南昌 330038); 2九江學(xué)院附屬醫(yī)院(江西九江 332000); 3井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院(江西吉安 343000)

急性肝損傷(acute liver injury,ALI)主要是由藥物肝毒性、病毒感染、酒精濫用或肝臟缺血再灌注引起的急性肝功能障礙的重要臨床綜合征,常以肝細(xì)胞變性、壞死和凋亡等為病理特征[1]。ALI的惡化可導(dǎo)致急性或慢性肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌,如果沒有得到及時(shí)有效的治療,嚴(yán)重的肝損傷可能是致命的[2]。統(tǒng)計(jì)顯示,每年每百萬人中總發(fā)病率為1～6例,接近每年2 000例。在美國,ALI每年占肝臟相關(guān)死亡的6%,占原位肝移植的7%[3]。血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin,TSP)是一個(gè)由TSP 1～5組成的多功能分泌型蛋白家族,分為A和B兩個(gè)亞家族。即A家族由TSP-1和TSP-2組成,它們是具有同源結(jié)構(gòu)的三聚體糖蛋白;B家族由TSP-3、TSP-4、TSP-5組成,它們是同源五聚體[4]。其中,TSP-1是一種450 kD的糖蛋白,由Baenziger等[5]首次從活化的血小板中分離出來。TSP-1的結(jié)構(gòu)由6個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成:1個(gè)氨基端域,1個(gè)前膠原蛋白同源區(qū),3種類型的重復(fù)(Ⅰ型重復(fù),Ⅱ型重復(fù),Ⅲ型重復(fù))和一個(gè)羧基端[4]。由于其不同的結(jié)構(gòu)域,它可以與多種受體相互作用,并表現(xiàn)出抗血管生成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)等的作用[6]。目前僅發(fā)現(xiàn)TSP-1在腎臟、血管、癌癥和代謝性疾病方面的研究最為廣泛[7],但在肝臟疾病方面的研究卻很少。因此,本研究于2021年7月至2023年1月完成實(shí)驗(yàn),旨在探討敲除TSP-1在小鼠ALI中的作用,并從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等角度分析分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本研究中所用C57BL/6J雄性小鼠(4～6周齡,體重20～25 g)購買于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可號SCXK(湘)2019-0014;本研究采用的TSP-1基因敲除雄性小鼠(4～6周齡,體重20～25 g)購買于Jackson實(shí)驗(yàn)室。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會審查和批準(zhǔn)(JXSETYY-YXKY-20220162)。

1.2 主要藥物和器械 四氯化碳(CCl4)、橄欖油購買于西隴科學(xué)股份有限公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購買于Promega生命科學(xué)公司;小鼠TSP-1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、丙二醛(MDA)比色法測試盒以及谷胱甘肽(GSH)比色法測試盒購買于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;TUNEL檢測試劑盒購于賽維爾生物科技有限公司;一抗(兔來源的caspase-3)、二抗(山羊抗兔)以及TSP-1和GAPDH引物購買于福州載基生物科技有限公司;離心機(jī)購買于德國艾本德股份有限公司;組織研磨儀購買于上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;全自動生化分析儀購買于長沙綜儀生物科技有限公司;光學(xué)顯微鏡購買于歐普林光電有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購買于美國伯樂公司;多功能酶標(biāo)儀購買于上海昆亞醫(yī)療器械股份有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物模型的建立及分組 選取16只C57BL/6J小鼠,隨機(jī)分為WT組(n=8),按照橄欖油10 mL/kg 體重進(jìn)行腹腔注射;WT+CCl4組(n=8),按照0.5 mL CCl4+9.5 mL橄欖油/kg(n=8),按照0.5 mL CCl4+橄欖油9.5 mL/kg體重進(jìn)行腹腔注射。實(shí)驗(yàn)終結(jié)于禁食不禁水24 h后,在麻醉狀態(tài)下采集血液和肝組織,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肝組織HE染色 將肝臟組織依次進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、水化、染色、分化、脫水、透明、封片,自然晾干,置于顯微鏡下觀察結(jié)構(gòu)并拍照。

1.3.3 肝功能檢測 取小鼠血液50 μL,用生理鹽水稀釋至200 μL,通過全自動生化分析儀測定ALT和AST水平。

1.3.4 RT-qPCR 取小鼠肝臟組織約40 mg,置于EP管中,每管加入1 mL Trizol,放入組織研磨儀5 min,然后按照RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系,在PCR儀上進(jìn)行反應(yīng),用2-ΔΔCt法計(jì)算TSP-1的mRNA的相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 所用引物序列

1.3.5 ELISA法檢測 取小鼠血清40 mL,用標(biāo)準(zhǔn)品和樣本稀釋液至100 mL,按照ELISA測定試劑盒說明書配置反應(yīng)液,放入酶標(biāo)儀上分別檢測TSP-1、IL-6和TNF-α的OD值。

1.3.6 比色法檢測 取小鼠肝臟組織約40 mg,置于EP管中,每管加入0.36 mL PBS液,放入組織研磨儀5 min,配置成10%組織勻漿。分別按照MDA和還原型GSH比色法說明書配置反應(yīng)液,酶標(biāo)儀上測OD值。

1.3.7 免疫組化法測定 切片依次進(jìn)行烤片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過氧化物酶、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色、復(fù)染、分化、脫水、封片,最后將玻片晾干,顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 切片依次進(jìn)行烤片、脫蠟水化,用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測肝組織中的凋亡細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0及SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALI傷時(shí)TSP-1的表達(dá)升高 ELISA和RT-qPCR分別檢測WT組和WT+CCl4組血清和肝臟中TSP-1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在血清和肝臟組織中,WT+CCl4組小鼠肝臟TSP-1的表達(dá)水平均明顯高于WT組小鼠(圖1A、B),表明小鼠ALI與TSP-1表達(dá)具有一定相關(guān)性。

注:A:ELISA法檢測小鼠血清中TSP-1的表達(dá)水平; B:PCR檢測肝臟組織中TSP-1 mRNA的表達(dá)水平圖1 小鼠肝臟TSP-1的表達(dá)水平

2.2 敲除TSP-1可減輕小鼠CCl4誘導(dǎo)的ALI 通過檢測小鼠血清中ALT和AST的水平以及HE染色法觀察肝臟綜合評估CCl4誘導(dǎo)小鼠ALI情況。生化結(jié)果顯示W(wǎng)T+CCl4組小鼠的ALT和AST顯著高于WT組,而相對于WT+CCl4組,TSP-1-/-+CCl4組小鼠血清ALT和AST顯著降低(圖2,P<0.05);HE染色WT+CCl4組小鼠肝細(xì)胞氣球樣變,可見大量灶狀壞死,以中央靜脈周圍為主,肝竇內(nèi)見炎癥細(xì)胞浸潤。而相對于WT+CCl4組,TSP-1-/-+CCl4組壞死面積減少,僅見少許炎性細(xì)胞浸潤(圖3),提示敲除TSP-1可減輕小鼠受到CCl4誘導(dǎo)的ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01圖2 各組小鼠血清中ALT和AST

注:WT組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心放射狀排列,未見壞死、氣球樣變;WT+CCl4組可見肝細(xì)胞呈片狀壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞;TSP-1-/-+CCl4組肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死,少許炎癥細(xì)胞浸潤圖3 各組小鼠肝臟病理組織學(xué)HE染色

2.3 敲除TSP-1可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕CCl4所致小鼠ALI 上述3組小鼠血清,通過ELISA測定炎癥因子TNF-α和IL-6水平。結(jié)果顯示,與WT對照組小鼠相比,WT+CCl4組的小鼠的TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05),而TSP-1-/-+CCl4組能顯著下調(diào)CCl4誘導(dǎo)的血清中TNF-α和IL-6的水平(圖4),提示敲除TSP-1可通過抑制炎癥減輕CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01圖4 ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平

2.4 敲除TSP-1可通過抑制氧化應(yīng)激減輕CCl4所致小鼠ALI 取上述3組小鼠肝臟組織,通過比色法測定氧化應(yīng)激因子MDA和GSH水平。結(jié)果顯示,與WT對照組小鼠相比,WT+CCl4組的小鼠肝臟組織中的MDA表達(dá)水平顯著升高,GSH表達(dá)水平顯著降低,而TSP-1-/-+CCl4組能顯著下調(diào)CCl4誘導(dǎo)的肝臟組織中MDA的表達(dá)水平和上調(diào)GSH的表達(dá)水平(圖5,P<0.05),提示敲除TSP-1可通過抑制氧化應(yīng)激減輕CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05, **P<0.01圖5 3組小鼠肝組織中MDA和GSH的含量

2.5 敲除TSP-1可通過抑制細(xì)胞凋亡減輕CCl4所致小鼠ALI 取上述3組肝臟組織切片,采用免疫組化法檢測肝細(xì)胞中caspase-3表達(dá)水平以及TUNEL法綜合評估肝細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示,WT+CCl4組肝組織中凋亡率較WT組升高,而TSP-1-/-+CCl4組較WT+CCl4組陽性率低(圖6),提示敲除TSP-1可通過抑制細(xì)胞凋亡減輕CCl4所致小鼠ALI。

3 討論

肝病仍然是備受世界關(guān)注的全球性難題,目前對肝病損傷的病理和發(fā)病機(jī)制取得重大的研究,其中炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是ALI發(fā)病機(jī)制的主要病理特征[8]。

在本研究中,我們首先成功構(gòu)建了CCl4誘導(dǎo)的ALI小鼠模型,發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比,模型組小鼠的TSP-1明顯升高(P<0.05),提示TSP-1可能參與了ALI的過程。為了進(jìn)一步闡明TSP-1在ALI中的作用及其可能的機(jī)制,我們使用了TSP-1敲除小鼠,并觀察到相對于WT+CCl4組小鼠,TSP-1-/-+CCl4組小鼠ALT和AST下降,肝臟損傷明顯減輕,表明敲除TSP-1可減輕CCl4誘導(dǎo)的ALI。

IL-6和TNF-α主要是由組織單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子,可以誘導(dǎo)參與各種炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)[9]。已有研究表明,TSP-1及其受體在免疫組織和參與抗炎過程的免疫細(xì)胞上表達(dá),可以激活單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子,如IL-6和TNF-α[10]。在本實(shí)驗(yàn)中,腹腔注射CCl4后,IL-6和TNF-α的表達(dá)水平明顯升高,而TSP-1基因敲除組則出現(xiàn)下降,說明敲除TSP-1基因可以通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕CCl4誘導(dǎo)的ALI。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是含有氧自由基的生物活性分子,在細(xì)胞生理上起著關(guān)鍵作用,但在高濃度時(shí)也有毒性,并能夠促進(jìn)病理過程[11]。ROS的毒性在于能夠氧化細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,并通過各種信號引起細(xì)胞損傷、功能紊亂和誘發(fā)細(xì)胞死亡[12]。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物,反映了體內(nèi)氧化反應(yīng)的程度并誘發(fā)細(xì)胞損傷[13]。MDA含量可以間接反映氧自由基的水平,GSH的水平可以反映機(jī)體的抗氧化能力[14]。TSP-1可以促進(jìn)自由基和ROS的過量產(chǎn)生[15]。例如,TSP-1通過激活受體CD47已被證明能刺激血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生ROS,通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進(jìn)血管功能障礙[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與CCl4模型組相比,TSP-1-/-組的MDA含量明顯下降,GSH含量明顯上升,說明TSP-1的敲除會增加肝臟的抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化的形成。

凋亡是肝細(xì)胞對各種破壞性因素的第一反應(yīng),凋亡后的細(xì)胞容易發(fā)生壞死[17]。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的激活在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中反復(fù)出現(xiàn),對細(xì)胞凋亡過程有重要影響。半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵促進(jìn)因素,在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用,并存在于多種細(xì)胞凋亡途徑的交叉點(diǎn)[18]。因此,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是負(fù)責(zé)執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素。此外,半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶的另一種作用機(jī)制是通過相互激活進(jìn)行自我激活,一旦細(xì)胞凋亡開始,啟動一連串的效應(yīng)[19]。有研究表明TSP-1誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡依賴于半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶,并由CD36受體引發(fā)的內(nèi)在凋亡連鎖反應(yīng)所介導(dǎo)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,WT+CCl4組的肝組織中caspase-3表達(dá)上調(diào)并且TUNEL顯示凋亡細(xì)胞亦顯著增加,而TSP-1-/-+CCl4組的肝組織中caspase-3表達(dá)明顯下降,提示TSP-1可能通過抑制caspase-3減弱細(xì)胞凋亡,從而減輕肝臟損傷。

因此,敲除TSP-1對CCl4誘導(dǎo)的小鼠ALI具有明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與改善炎癥、降低氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。未來有望通過檢測TSP-1的表達(dá)水平來評估肝損傷的嚴(yán)重程度,為早期診斷肝損傷提供參考以及為研發(fā)靶向生物制劑精準(zhǔn)化治療肝損傷提供新方向。

利益相關(guān)聲明:本文所有作者共同認(rèn)可論文,無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:研究設(shè)計(jì)為占敏;研究方案執(zhí)行為吳敏、馮偉柯、占一姍、張守華;數(shù)據(jù)整理為占一姍、王劍巧;統(tǒng)計(jì)分析為曾金娣、李科浩;論文撰寫為吳敏,論文評閱為占敏、陶強(qiáng)。