劉相城，付宏，劉春柏，張爽，胡姣月，鮑金，趙增霞，羅翰，符鵬程，劉淑云

作者單位：深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 深圳 518110

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是神經(jīng)功能損傷臨床綜合征，主要由腦部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致大腦缺血缺氧引起［1］，具有較高的發(fā)病率和致殘率［2］。研究表明，ACI 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與腦動脈側(cè)支循環(huán)的形成和開放密切相關(guān)［3］，腦動脈側(cè)支循環(huán)的形成能夠促使缺血區(qū)域恢復(fù)血供，從而降低梗死面積，起到保護(hù)腦組織的作用［4］。因此，預(yù)測腦動脈側(cè)支循環(huán)形成情況，在指導(dǎo)ACI 病人臨床治療過程中扮演著極其重要角色。微RNA（miRNA，miR）屬于短鏈非編碼RNA，在真核生物中具有調(diào)控功能，包含21～23 個核苷酸序列，可與目標(biāo)基因mRNA 的3’非翻譯區(qū)（UTR）堿基配對結(jié)合［5］，參與調(diào)控機(jī)體多種生物學(xué)功能。miR-181b 隸屬于miR-181 家族成員，可調(diào)控心血管組織細(xì)胞中細(xì)胞因子、蛋白酶及相關(guān)受體的基因表達(dá)，參與心血管疾病的病理過程［6］。因此本研究主要探討miR-181b在早期ACI病人外周血中的表達(dá)情況及其表達(dá)與病人腦側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性，分析ACI 病人側(cè)支循環(huán)形成的影響因素，以期為ACI 的臨床治療提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015 年6 月至2019 年5 月在深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的行數(shù)字減影血管造影（DSA）檢查符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［7］診斷標(biāo)準(zhǔn)的ACI 病人175例作為研究對象，男性129 例，女性46 例，病人年齡（58.17±17.96）歲，范圍為29～85 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）納入病人初次發(fā)病，且在24 h 內(nèi)入院治療；（2）納入病人均經(jīng)核磁共振成像或CT 檢查證實(shí)存在責(zé)任病灶；（3）就診前2個月病人未服用過他汀類以及促紅細(xì)胞生存素藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）出血性腦疾病、腦血管畸形或合并動脈炎者；（2）伴隨有嚴(yán)重臟器功能障礙的病人；（3）伴隨有惡性腫瘤、感染及凝血障礙病人；（4）已接受溶栓或取栓治療者；（5）進(jìn)展性腦梗死、心源性腦梗死或腦梗死后出血轉(zhuǎn)化者。納入研究對象均簽署知情同意書，獲深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號2015-283-06）。

1.2 臨床資料收集病人臨床資料通過查閱電子病歷獲得，包括病人的性別、年齡、吸煙史、冠心病史、糖尿病史、高血壓史、飲酒史等。入院后，等病人平穩(wěn)狀態(tài)測量血壓記錄收縮壓和舒張壓。入院后次日清晨，空腹（空腹時間在8 h 以上）采集肘靜脈血5 mL，離心獲得血清（離心條件：3 000 r/min，半徑10 cm，15 min），檢測總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖、血同型半胱氨酸（Hcy）、血尿酸、血漿纖維蛋白原（FIB）及C 反應(yīng)蛋白（CRP）及白細(xì)胞計(jì)數(shù)。其中高血壓定義：既往高血壓病且正在服用降壓藥或者血壓≥140/90 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；吸煙者定義：目前吸煙或者戒煙不足1個月。

1.3 方法

1.3.1 腦血管造影檢查病人入院第5天行DSA檢查。局麻后行股動脈穿刺，選擇改良Seldinger 穿刺術(shù)，穿刺成功后將5F 或8F 動脈鞘置入，靜脈推注肝素2 500 U，然后在主動脈弓中將導(dǎo)絲和5F pigtail導(dǎo)管置入，注射造影劑（碘普羅胺），行主動脈弓造影，觀察主動脈弓及弓上大血管結(jié)構(gòu)，確認(rèn)無斑塊或狹窄，進(jìn)行后續(xù)操作。pigtail導(dǎo)管從中拔出，然后將5F椎動脈導(dǎo)管分別置于雙側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、外動脈及椎基底動脈，注射碘普羅胺，分別行上述動脈正位、側(cè)位及顱內(nèi)DSA檢查。

1.3.2 腦梗死體積測定病人行DSA 后，進(jìn)行頭部CT 檢查，測量低密度灶的長寬厚3 徑，然后計(jì)算腦梗死灶體積（cm3）=長×寬+CT掃描陽性層數(shù)×π/6，若有多個病灶，累加總體積即為腦梗死體積。

1.3.3 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR， RT-qPCR）采用RT-qPCR 法檢測血清miR-181b 表達(dá)水平，采用Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司）和miRNeasy Mini Kit 試劑（德國Qiagen 公司）盒提取血清總miRNA，NanoDrop 2000超微量核酸測定儀檢測miRNA 濃度，取2 μg檢驗(yàn)合格的血清miRNA 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），以cDNA 為模板采用SYBR Gene RealtimePCRMaster Mix 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 反應(yīng)。miR-181b 正向引物：5'-AACATTCATTGCTGTCGGTGGG-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3'；U6 正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。RT-qPCR 在7500實(shí)時熒光定量PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行，反應(yīng)設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，74 ℃ 30 s，38個循環(huán)，反應(yīng)均以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-181b的相對表達(dá)量。

1.4 評估標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評分神經(jīng)功能采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評估：NIHSS 評分≤6 分為輕度神經(jīng)功能損傷；7～14 分為中度神經(jīng)功能損傷；≥15分為重度神經(jīng)功能損傷。

1.4.2 血管狹窄程度判定標(biāo)準(zhǔn)頸動脈狹窄程度計(jì)算：采用北美癥狀性頸動脈內(nèi)膜切除試驗(yàn)［8］，即：狹窄率（%）=（1-最狹窄動脈管徑/正常動脈管徑）×100%。狹窄程度分級：0＜狹窄程度≤29%為輕度狹窄；29%＜狹窄程度≤69%為中度狹窄；69%＜狹窄程度＜100%為重度狹窄；狹窄程度=100%為閉塞。

1.4.3 側(cè)支循環(huán)形成及血流分級標(biāo)準(zhǔn)［8］前交通動脈開放標(biāo)準(zhǔn)：一側(cè)頸內(nèi)動脈造影見對比劑經(jīng)前交通動脈顯影對側(cè)大腦前、中動脈主干及分支；后交通動脈開放標(biāo)準(zhǔn)：椎動脈造影顯示造影劑通過后交通動脈顯影了頸內(nèi)動脈主干和分支；吻合側(cè)支循環(huán)開放標(biāo)準(zhǔn)：包括軟腦膜動脈和眼動脈，經(jīng)一支動脈的分支或主干通過另一支動脈的尖端逆行形成。

側(cè)支循環(huán)的開放途徑分為3 個等級［9］。一級：依靠Willis 環(huán)的血流代償實(shí)現(xiàn)側(cè)支循環(huán)，包括前、后交通動脈；二級：依靠眼動脈、軟腦膜吻合支及其他相對較小的側(cè)支與側(cè)支吻合支之間的血流代償實(shí)現(xiàn)側(cè)支循環(huán)；三級：新生血管形成。側(cè)支循環(huán)血流灌注分級，采用美國放射介入學(xué)會（ASITN/SIR）的側(cè)支循環(huán)評估系統(tǒng)：0 級，完全無側(cè)支血流供應(yīng)；l級，非梗死區(qū)域血流緩慢灌注；2 級，非梗死區(qū)域血流快速灌注；3 級，梗死區(qū)域血流緩慢灌注；4 級，梗死區(qū)域血流快速灌注。側(cè)支血流0～2級納入側(cè)支循環(huán)不良組，側(cè)支血流3～4級納入側(cè)支循環(huán)良好組。

1.5 訓(xùn)練集與測試集分組將175例ACI病人按照3∶1 的比例，采用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)分為訓(xùn)練集（129 例）和測試集（46 例），分別用于構(gòu)建側(cè)支循環(huán)形成不良預(yù)測模型和驗(yàn)證模型預(yù)測效能。兩組病人性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)和側(cè)支循環(huán)形成不良比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 訓(xùn)練集與測試集ACI病人一般臨床資料比較

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。定性資料使用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。正態(tài)分布定量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布定量資料以中位數(shù)（第25、75百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。使用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)ACI 病人血清miR-181b 表達(dá)與側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性。腦側(cè)支循環(huán)形成不良因素分析采用logistic 回歸模型。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACI 病人臨床資料及側(cè)支循環(huán)形成情況訓(xùn)練集中側(cè)支循環(huán)形成良好病人90例，側(cè)支循環(huán)形成不良病人39例。單因素分析結(jié)果顯示，兩組病人性別、年齡、糖尿病史、飲酒史、病變位置、總膽固醇、收縮壓、舒張壓、三酰甘油、LDL-C、FIB、CRP 和白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。側(cè)支循環(huán)良好組吸煙比例、總膽固醇、高血壓比例、空腹血糖、Hcy、血尿酸、冠心病比例、梗死體積均顯著低于側(cè)支循環(huán)形成不良組，而腦血管重度狹窄或閉塞病人比例以及miR-181b 相對表達(dá)量顯著高于側(cè)支循環(huán)形成不良組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 訓(xùn)練集129例ACI病人側(cè)支循環(huán)形成良好和不良組一般臨床資料比較

2.2 不同側(cè)支循環(huán)代償ACI病人血清miR-181b表達(dá)水平及NIHSS 評分訓(xùn)練集無側(cè)支循環(huán)開放病人17 例（13.18%），存在側(cè)支循環(huán)的病人112 例（86.82%），其中一級側(cè)支循環(huán)開放病人54 例（41.86%），僅前交通動脈開放者14 例（10.85%），僅后交通動脈開放者17 例（13.18%），前、后交通動脈均開放者23 例（17.83%）；二級側(cè)支循環(huán)開放病人35 例（27.13%），其中軟膜動脈代償20 例（15.50%），眼動脈代償15 例（11.63%），三級代償病人23 例（17.83%）。和無代償組相比，血清miR-181b水平在一級代償組、二級代償組、三級代償組ACI病人呈現(xiàn)逐步升高趨勢，而NIHSS 評分在三組中呈現(xiàn)逐步下降趨勢，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表3。

表3 訓(xùn)練集129例不同側(cè)支循環(huán)開放類型病人血清miR-181b水平及NIHSS評分比較/

表3 訓(xùn)練集129例不同側(cè)支循環(huán)開放類型病人血清miR-181b水平及NIHSS評分比較/

注：NIHSS為美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表。

?

2.3 ACI 病人腦側(cè)支循環(huán)形成不良的影響因素將單因素分析中具有顯著性的因素按表4 進(jìn)行賦值，采用似然比前進(jìn)法對變量進(jìn)行篩選，然后納入非條件logistic 多因素分析，結(jié)果顯示，高血壓史、Hcy、后循環(huán)病變均為腦梗死病人側(cè)支循環(huán)形成不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；miR-181b 相對表達(dá)量和腦血管狹窄程度為側(cè)支循環(huán)形成不良的保護(hù)因素，見表5。

表4 ACI病人129例側(cè)支循環(huán)形成不良影響因素賦值量表

表5 訓(xùn)練集129例ACI病人側(cè)支循環(huán)形成不良多因素分析

2.4 血清miR-181b 水平與病人側(cè)支循環(huán)形成的相關(guān)性分析Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-181b 表達(dá)水平與ACI 病人腦側(cè)支循環(huán)形成情況呈顯著正相關(guān)（r=0.77，P＜0.001）。

2.5 ACI 病人側(cè)支循環(huán)形成不良的預(yù)測模型建立根據(jù)logistic回歸分析結(jié)果，側(cè)支循環(huán)形成不良預(yù)測值=EXP［0.491-1.914（高血壓史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相對表達(dá)量）-1.286（后循環(huán)病變）+0.594（腦血管狹窄程度）］/1+EXP［0.491-1.914（高血壓史）-1.409（Hcy）+2.145（miR-181b 相對表達(dá)量）-1.286（后循環(huán)病變）-0.594（腦血管狹窄）］。該模型曲線下面積（AUC）為0.88［95%CI：（0.84，0.92）］。測試集ACI病人側(cè)支循環(huán)形成不良預(yù)測模型AUC為0.80［95%CI：（0.76，0.88）］。兩組病人AUC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

ACI 是臨床常見的腦卒中類型，是一種常見的腦部血液循環(huán)障礙類疾病，其發(fā)病原因主要是腦供血血管的狹窄或閉塞，而側(cè)支循環(huán)形成可以在一定程度上改善缺血部位供血，從而發(fā)揮保護(hù)腦組織的功能［10］。伴隨著我國老齡化加劇以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，ACI 發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢。miRNA 可調(diào)控蛋白表達(dá)并具有較高的穩(wěn)定性，在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程中扮演重要角色發(fā)揮作用［11］。miR-181b 為內(nèi)源性短小RNA，參與動脈粥樣硬化、心肌纖維化、主動脈瓣膜病等疾病的病理過程。祁緣、荊黎［6］的研究表明認(rèn)為miR-181b 在心血管疾病的調(diào)控過程中扮演著極其重要角色。劉振等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，沉默LncRNA SNHG7 通過調(diào)控可通過調(diào)控miR-181b表達(dá)參與到心肌損傷修復(fù)過程。以上結(jié)果提示miR-181b 參與調(diào)控心血管疾病的病理過程，但miR-181b 在ACI 病人外周血中的表達(dá)及其表達(dá)水平與腦側(cè)支循環(huán)形成的關(guān)系還鮮有報(bào)道。

本研究排除性別、年齡等一般臨床資料的影響后發(fā)現(xiàn)，側(cè)支循環(huán)形成不良組血清miR-181b相對表達(dá)量顯著低于側(cè)支循環(huán)形成良好組。通常將腦側(cè)支循環(huán)分為三級：當(dāng)腦動脈發(fā)生狹窄或閉塞時，Willis 環(huán)即前、后交通動脈開放，此時新建立的側(cè)支循環(huán)可以幫助腦動脈系統(tǒng)向患側(cè)供應(yīng)血液，然而如果一級代償無法提供足夠代償時，軟膜動脈、眼動脈及其他較小的側(cè)支代償成為二級代償，三級代償指腦缺血或梗死區(qū)域周圍形成新生血管［13］。本研究結(jié)果表明，一級側(cè)支循環(huán)開放率（41.86%）顯著高于二級代償（21.73%）和三級代償（17.83%），提示一級側(cè)支循環(huán)開放為ACI病人腦動脈狹窄或閉塞時的主要代償方式。和無代償組相比，血清miR-181b水平在一級代償組、二級代償組、三級代償組當(dāng)中呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，而NIHSS 評分則在三組當(dāng)中呈現(xiàn)逐步下降趨勢。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-181b 表達(dá)水平與腦側(cè)支循環(huán)形成情況呈顯著正相關(guān)，上述結(jié)果表明血清miR-181b水平高低與ACI病人側(cè)支循環(huán)形成良好程度關(guān)系密切。

眾所周知，腦側(cè)支循環(huán)的形成過程當(dāng)中會受到多種因素影響，本研究單因素分析結(jié)果顯示，吸煙、總膽固醇、空腹血糖、高血壓史、Hcy、血尿酸、梗死體積、冠心病史、血清miR-181b 表達(dá)水平及腦血管重度狹窄程度均為ACI病人側(cè)支循環(huán)形成不良的影響因素，隨后將單因素分析P＜0.05 的指標(biāo)納入到多因素logistic 模型當(dāng)中分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-181b相對表達(dá)量、腦血管狹窄程度為ACI 病人側(cè)支循環(huán)形成不良的保護(hù)因素，高血壓史、Hcy、后循環(huán)病變?yōu)锳CI病人側(cè)支循環(huán)形成不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此在臨床實(shí)際工作當(dāng)中，應(yīng)該時刻關(guān)注病人的miR-181b水平、腦血管狹窄程度、高血壓史、Hcy、后循環(huán)病變情況，提前干預(yù)，做好預(yù)防。研究表明，高血壓對軟腦膜側(cè)支重塑具有抑制作用，不利于側(cè)支循環(huán)形成［14］。Hcy 為敏感的炎性因子，可釋放大量氧自由基及過氧化物，對人體抗氧化機(jī)制產(chǎn)生抑制作用，高Hcy 水平是心腦血管病的危險(xiǎn)因素［15-16］。與前循環(huán)病變比較，后循環(huán)病變時側(cè)支循環(huán)開放的途徑較少，因此后循環(huán)病變ACI 病人更容易側(cè)支循環(huán)形成不良［17］。腦血管狹窄是腦側(cè)支循環(huán)形成的重要影響因素［18］，腦血管輕度或中度狹窄時，腦組織依靠自身彈性及神經(jīng)調(diào)節(jié)恢復(fù)缺血區(qū)血流，側(cè)支循環(huán)代償較少，重度狹窄或閉塞時，低灌注的加重導(dǎo)致壓力差出現(xiàn)，腦側(cè)支循環(huán)代償開放較多［19］。根據(jù)訓(xùn)練集中l(wèi)ogistic回歸分析結(jié)果構(gòu)建ACI病人側(cè)支循環(huán)形成不良預(yù)測模型，該模型AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.92）］，對ACI病人側(cè)支循環(huán)形成不良具有較好的預(yù)測價值。

綜上所述，側(cè)支循環(huán)良好病人外周血血清miR-181b 表達(dá)水平較高，腦血管狹窄程度輕和高水平miR-181b 為側(cè)支循環(huán)形成不良的保護(hù)因素，而高血壓史、Hcy、后循環(huán)病變均為腦梗死病人側(cè)支循環(huán)形成不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，當(dāng)然本研究也存在一定的不足之處，本研究屬于單中心研究，納入研究對象可能不足，導(dǎo)致部分結(jié)果存在偏倚，因此下一步我們將開展多中心大樣本研究，從而對本研究成果進(jìn)一步地驗(yàn)證。