姚潔，王尚臣，褚麗芳，朱倩

作者單位：石家莊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，河北 石家莊 050000

腦卒中是一種具有高復(fù)發(fā)率、高致殘率的急性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，我國每年約200 萬新發(fā)病例［1］。血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impair-ment，VCI）是由于腦血管損傷導(dǎo)致的認(rèn)知能力降低和生活能力減退的綜合征，是老年人常見的認(rèn)知障礙，其包括從輕度認(rèn)知障礙到血管性癡呆（vascular dementia，VD）［2］。據(jù)報道，30%的腦卒中病人將出現(xiàn)不同程度的VCI，影響腦卒中后病人康復(fù)，并給家庭、社會造成負(fù)擔(dān)［3］。VCI 具有可防治性，發(fā)病早期有效診療能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)病情，減少癡呆發(fā)生。因此，需要更好地了解VCI 疾病進(jìn)展的病理生理學(xué)，以制定新的干預(yù)措施。

微RNA（microRNA，miR）屬于小型無編碼能力的RNA，以往研究證實miRNA 在VCI 病人血清、腦脊液等體液循環(huán)中差異表達(dá)，容易檢測，是一種新型VCI診斷指標(biāo)［4］。miR-335-5p是miRNA 家族成員之一，有研究指出，miR-335-5p 在VD 中具有重要作用，可以作為VD 診斷、治療標(biāo)志物［5］。亦有研究指出，50%肌萎縮側(cè)索硬化癥病人表現(xiàn)出行為和認(rèn)知功能障礙，且血清中檢測到miR-335-5p水平降低［6］。血清應(yīng)答因子（vascular cognitive impair-ment，SRF）位于染色體6p21.1 上，是一種普遍表達(dá)的MADSbox轉(zhuǎn)錄因子，參與氧化應(yīng)激。SRF在阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）中的高表達(dá)能夠推動疾病進(jìn)展［7］。本研究通過檢測腦卒中后VCI 病人血清miR-335-5p、SRF 水平，并進(jìn)一步明確miR-335-5p、SRF 異常表達(dá)與認(rèn)知功能的相關(guān)性，以期為VCI 的早期診斷與治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料以石家莊市人民醫(yī)院2019 年1 月至2020 年12 月因腦卒中治療后6 個月合并VCI 病人110 例為研究對象（VCI 組），且蒙特利爾認(rèn)知評估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評分＜26 分，其中男67 例、女43 例，年齡（61.46±8.15）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①腦卒中診斷符合《中國急性腦卒中臨床研究規(guī)范共識2018》［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合臨床檢查確診；②VCI符合《2016中國血管性認(rèn)知障礙診療指導(dǎo)規(guī)范》診斷標(biāo)準(zhǔn)，且治療后6 個月的腦卒中病人MoCA 評分＜26 分［9］。③年齡≥18 歲，首次確診為腦卒中；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病前存在認(rèn)知障礙、繼發(fā)性腦卒中病人；②合并肢體功能障礙、合并心肺肝腎疾??；③合并失語、構(gòu)音障礙、視覺障礙或聽覺障礙，無法完成檢查；④凝血功能障礙；⑤腦腫瘤或其他顱腦疾??；⑥早期出現(xiàn)進(jìn)行性惡化的記憶缺陷。本研究經(jīng)石家莊市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意（批號2018-11-0178）。將110例病人進(jìn)一步根據(jù)《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第5 版［10］分為非癡呆型血管性認(rèn)知功能障礙（vascular cognitive impairment with no dementia，VCIND）組，血管性癡呆（VD）組。同時間段該院110例腦卒中無VCI 的病人作為對照組，男69 例，女41例，年齡（59.08±8.36）歲。腦卒中病人發(fā)病后6個月時采用MoCA 評估受試者認(rèn)知功能，并將MoCA 評分＜26 分的病人作為VCI 組。同時對腦卒中病人于發(fā)病時（入院次日）、發(fā)病后1 年分別采用MoCA 評估受試者認(rèn)知功能，比較VCIND 組、VD 組以及對照組病人MoCA評分差異。

1.2 方法

1.2.1 資料收集入院時統(tǒng)計病人以下資料：（1）一般資料：年齡、性別、基礎(chǔ)疾病史、飲酒史（乙醇量≥36 g/d，持續(xù)半年）、腦卒中類型（出血性/缺血性）、腦卒中部位（皮層/基底核/丘腦/小腦/腦干/其他）、吸煙史（≥1 支/天，持續(xù)半年）、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評分等；（2）入院時生化指標(biāo)檢查結(jié)果：三酰甘油、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、空腹血糖、總膽固醇、血同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測血清miR-335-5p、SRF 水平所有研究對象分別于發(fā)病時（入院次日）、發(fā)病后6 個月、發(fā)病后1 年時清晨抽取空腹肘靜脈血，離心半徑8 cm，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，并置于-80 ℃超低溫冰箱中貯存，備用。采用miRNA 抽提試劑盒（貨號DP503）得到miRNA，按照miRcute 增強(qiáng)型miRNA 互補(bǔ)DNA（cDNA）第一鏈合成試劑盒（貨號KR211-01）說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后稀釋至等量濃度，使用熒光定量檢測試劑盒（貨號FP411）中反應(yīng)混合液配制反應(yīng)體系，并在Mx3005P QPCR（Aglient，美國）擴(kuò)增儀上采集信號。

取血清樣品，采用Trizol試劑（貨號DP424）得到總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號KR106）得到cDNA，利用FastFire qPCR PreMix 試劑盒（貨號FP207）配制混合體系，同樣在Mx3005P QPCR 儀器上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。miR-335-5p以U6為內(nèi)參，SRF 以β 肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。試劑盒均由天根生化科技有限公司提供。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR檢測血清miR-335-5p、SRF水平引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 23.0 處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料如CRP、SRF、NIHSS 評分以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，三組間行單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較為LSD 法；不同時間點(diǎn)血清miR-335-5p、SRF 水平及MoCA 評分比較采用雙因素重復(fù)測量方差分析。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。logistic 回歸模型分析腦卒中病人發(fā)生VCI 的影響因素。Peasrson 法分析血清miR-335-5p 與SRF 水平的相關(guān)性。受試者操作特征曲線（ROC 曲線）分析血清miR-335-5p、SRF 預(yù)測腦卒中后VCI 的效能，曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者基線資料比較對照組與VCI 組受試者年齡、飲酒史、NIHSS 評分、Hcy 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組受試者性別、吸煙史、腦卒中類型、腦卒中部位、受教育年限、高血壓、糖尿病、冠心病、高脂血癥、三酰甘油、總膽固醇、LDL-C、CRP、HDL-C 及空腹血糖水平相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組受試者基線資料及臨床指標(biāo)分析

2.2 兩組受試者血清miR-335-5p、SRF 水平比較對照組與VCI 組受試者發(fā)病時血清miR-335-5p、SRF 水平比較顯示，VCI 組血清miR-335-5p 表達(dá)水平低于對照組（0.76±0.15 比1.06±0.07），SRF 水平高于對照組（1.52±0.24比1.01±0.09），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=19.01、20.87，均P＜0.001）。

2.3 三組受試者不同時間點(diǎn)血清miR-335-5p、SRF水平及MoCA 評分比較對照組受試者發(fā)病時、發(fā)病后6個月及1年時MoCA評分、miR-335-5p、SRF水平相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。VD 組、VCIND 組受試者在發(fā)病后6 個月、發(fā)病后1 年時MoCA 評分、SRF 水平低于發(fā)病時，而miR-335-5p 水平高于發(fā)病時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；VD 組受試者發(fā)病后1年MoCA 評分低于發(fā)病后6個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；VCIND 組發(fā)病后1 年受試者M(jìn)oCA 評分、miR-335-5p 水平、SRF 水平與發(fā)病后6 個月相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。發(fā)病時，三組受試者的MoCA評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而對照組、VCIND 組、VD 組的miR-335-5p 水平逐次降低，SRF水平呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。發(fā)病后6 個月及發(fā)病后1 年時，對照組、VCIND 組、VD 組MoCA 評分均逐次降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而miR-335-5p水平、SRF水平無明顯變化（P＞0.05）。三組MoCA評分、miR-335-5p、SRF 組間、時間、交互作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組受試者不同時間點(diǎn)MoCA評分、血清miR-335-5p及SRF水平比較/

表3 三組受試者不同時間點(diǎn)MoCA評分、血清miR-335-5p及SRF水平比較/

注：MoCA 評分為蒙特利爾認(rèn)知評估量表評分，SRF 為血清應(yīng)答因子。①與本組發(fā)病時相比，P＜0.05。②與對照組同時間相比，P＜0.05。③與本組發(fā)病后6個月相比，P＜0.05。④與VD組同時間相比，P＜0.05。

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2.4 相關(guān)性分析發(fā)病時，VCI 組血清miR-335-5p與SRF水平存在負(fù)相關(guān)性（r=-0.64，P＜0.001）。

2.5 腦卒中病人發(fā)生VCI 的影響因素分析以VCI 為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的年齡、NIHSS 評分、飲酒史、Hcy、miR-335-5p、SRF為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析。年齡、NIHSS 評分、miR-335-5p、SRF 是影響腦卒中病人發(fā)生VCI 的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 腦卒中病人220例發(fā)生VCI的影響因素分析

2.6 血清miR-335-5p、SRF 預(yù)測VCI 的ROC 曲線ROC 分析顯示，血清miR-335-5p 水平預(yù)測腦卒中后VCI 的AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，截斷值為0.92，靈敏度為78.20%，特異度為87.30%；血清SRF 水平預(yù)測腦卒中后VCI 的AUC 為0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，截斷值為1.20，特異度為93.60%，靈敏度為79.10；miR-335-5p 聯(lián)合SRF 預(yù)測VCI 的AUC為0.93［95%CI：（0.89，0.97）］，特異度為89.20%，靈敏度為79.10%。3 種預(yù)測方式的AUC 比較顯示：miR-335-5p 與SRF 的Z=0.66、P=0.511，miR-335-5p與聯(lián)合的Z=2.28、P=0.023，SRF與聯(lián)合的Z=2.12、P=0.034。

3 討論

VCI 是由多種腦血管疾病引起的異質(zhì)性疾病，表現(xiàn)為認(rèn)知處理速度較慢、執(zhí)行功能較差，致殘率高［2］。腦卒中是臨床常見且具有高致殘率的腦血管疾病，約30%的病人在發(fā)病后出現(xiàn)VCI［11］。目前，VCI的臨床診斷包括臨床評估、神經(jīng)影像學(xué)檢查、神經(jīng)認(rèn)知功能測試，但均存在診斷局限性［12］。其中，VCI 病人出現(xiàn)明顯癥狀時已處于晚期，錯過最佳治療時間；神經(jīng)影像學(xué)檢查難以區(qū)分VD 及AD；神經(jīng)認(rèn)知功能測試尚無廣泛認(rèn)可的認(rèn)知功能測試。因而，需要探究能夠用于臨床早期診斷VCI 的血清學(xué)指標(biāo)，以便于及時采取治療措施，有效逆轉(zhuǎn)病情，避免癡呆等不良后果。本研究結(jié)果顯示，對照組與VCI組受試者年齡、飲酒史、NIHSS評分、Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；并經(jīng)logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡、NIHSS 評分是影響腦卒中病人VCI 的危險因素。黃曉蕓等［13］同樣發(fā)現(xiàn)，年齡、NIHSS評分是影響腦卒中后VCI的危險因素，說明對于高齡、NIHSS 評分較高者，臨床上應(yīng)給予重視。

VCI 涉及多種病理生物學(xué)變化，腦灌注不足和神經(jīng)血管單元損傷是VCI 的主要病理生物學(xué)機(jī)制，而炎癥因子的大量釋放通過作用于局部神經(jīng)元，通過破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，影響認(rèn)知功能［14］。以往研究顯示，miRNA 在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元發(fā)育、造血、受損組織的修復(fù)和重塑、氧化應(yīng)激等中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。近期，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p 可能是腦卒中［15］、VD［5］的關(guān)鍵預(yù)后標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。此外，miR-335-5p 還在肌萎縮側(cè)索硬化癥病人血清中下調(diào)表達(dá)，miR-335-5p 的下調(diào)會增強(qiáng)SH-SY5Y 的線粒體自噬和凋亡，增加活性氧和超氧化物歧化酶活性［6］。本研究首次利用熒光定量PCR 技術(shù)檢測了miR-335-5p 在腦卒中后VCI 病人血清中水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VD 組發(fā)病時血清miR-335-5p 表達(dá)水平明顯低于VCIND 組、對照組，VCIND 組又低于對照組，說明血清miR-335-5p 表達(dá)水平越低，腦卒中后認(rèn)知功能障礙越嚴(yán)重。發(fā)病后6 個月及1 年時VCIND 組、VD 組血清miR-335-5p 水平即恢復(fù)至對照組水平，說明miR-335-5p 可能僅在腦卒中后前期參與認(rèn)知功能障礙形成過程。過表達(dá)miR-335-5p能夠抑制炎癥因子分泌，降低G 蛋白偶聯(lián)受體激酶4 表達(dá)水平，保護(hù)HA-VSMC 減少損傷［16］。基于本研究結(jié)果，推測腦卒中病人發(fā)病時血清miR-335-5p 越低，病人越易發(fā)生認(rèn)知功能障礙，而miR-335-5p 的低表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體炎癥因子大量分泌，損傷血管內(nèi)皮，斑塊形成，阻礙血運(yùn)重建，加速腦血管損傷，增加VCI 風(fēng)險。本研究多因素logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p 水平降低是VCI 發(fā)生的獨(dú)立危險因素，說明miR-335-5p 水平與腦卒中后認(rèn)知障礙發(fā)生顯著相關(guān)，miR-335-5p 水平減少，VCI 發(fā)生風(fēng)險增加。因而，本研究利用ROC 曲線分析了miR-335-5p 對VCI 的預(yù)測價值，發(fā)現(xiàn)AUC 為0.88［95%CI：（0.84，0.93）］，提示腦卒中病人發(fā)病時檢測血清miR-335-5p水平能夠及早預(yù)測VCI發(fā)生，并盡早治療。

SRF 是一種高度通用性轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的遷移、神經(jīng)突出、軸突和樹突分化以及突觸功能［17］。SRF的缺失導(dǎo)致小鼠模型體內(nèi)肝星狀細(xì)胞的活性氧水平，改善肝纖維化，說明SRF 參與氧化應(yīng)激過程［18］。SRF還在AD小腦動脈中的過表達(dá)，能激活SRF 依賴的SM 收縮基因而增加動脈收縮力減少血流量，被證實有助于疾病進(jìn)展［7］。本研究結(jié)果顯示，在VCI 組受試者血清中SRF 水平明顯高于對照組，說明SRF 與認(rèn)知功能障礙形成有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)病時，對照組、VCIND 組、VD 組SRF 水平逐次升高，說明腦卒中后SRF 水平越高，病人后期認(rèn)知障礙越嚴(yán)重；發(fā)病后6 個月、發(fā)病后1 年時VCIND 組、VD 組血清SRF 恢復(fù)至與對照組相同水平，說明SRF 可能僅參與腦卒中發(fā)病后VCI 形成過程，當(dāng)VCI 形成后，病人SRF 水平即恢復(fù)至正常水平。SRF 水平升高是影響VCI 發(fā)生的危險因素，說明SRF 水平與認(rèn)知障礙程度有關(guān)，早期監(jiān)測血清SRF 水平變化，能夠輔助臨床VCI的診斷。此外，有學(xué)者認(rèn)為SRF 可替代Scr 作為AKI 潛在的新早期診斷標(biāo)志物［19］。本研究ROC 顯示，血清SRF 水平預(yù)測腦卒中后VCI 的AUC 為0.90［95%CI：（0.86，0.95）］，提示SRF 預(yù)測VCI 的效能較高。Pearson 相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-335-5p與SRF存在負(fù)相關(guān)，說明二者可能在腦卒中后VCI 過程中存在相互作用，但具體調(diào)控機(jī)制仍待后續(xù)探究。為了提高miR-335-5p、SRF 對VCI 預(yù)測效能，本研究將miR-335-5p 聯(lián)合SRF 預(yù)測VCI，結(jié)果顯示AUC 為0.93，明顯高于miR-335-5p、SRF 單獨(dú)預(yù)測效能，這說明將miR-335-5p 聯(lián)合SRF能顯著提高診斷效能。

綜上所述，miR-335-5p、SRF 與腦卒中后VCI 形成密切相關(guān)，miR-335-5p 水平降低，SRF 水平上升，將導(dǎo)致VCI 病情加重，且二者聯(lián)合能夠用于臨床預(yù)測VCI 發(fā)生。本研究納入樣本量較少，血清miR-335-5p、SRF 對腦卒中后VCI 發(fā)生的預(yù)測效能還需要后續(xù)擴(kuò)大樣本量論證，同時需要開展細(xì)胞實驗等探究miR-335-5p、SRF在VCI中的具體調(diào)控機(jī)制。