李瑾，李雨靜，邢暉林，鄧喜文，郭明好

作者單位：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000

慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases，CKD）全球發(fā)病率已超過(guò)10%，呈現(xiàn)發(fā)病率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)［1］。慢性腎臟病骨代謝異常（chronic kidney diseases bone disorder，CKD-BD）特指與CKD 相關(guān)的骨組織學(xué)異常，臨床表現(xiàn)為骨痛、骨骼變形及骨折發(fā)生率增加，是CKD 礦物質(zhì)及骨代謝異常（chronic kidney disease-mineral bone disorder，CKD-MBD）的重要組成部分，是CKD 的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是病人致殘、致死等不良結(jié)局的重要原因之一［2］。目前CKDBD發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療效果欠佳。尿毒癥毒素是指隨著CKD 進(jìn)展、腎小球?yàn)V過(guò)率下降，不斷蓄積在病人體內(nèi)的異常代謝產(chǎn)物，可導(dǎo)致代謝紊亂或產(chǎn)生一系列臨床表現(xiàn)［3］。目前已有研究證實(shí)尿毒癥毒素參與了CKD 病人多種并發(fā)癥發(fā)生，例如尿毒癥心肌病、尿毒癥腦病等［4-5］，然而尿毒癥毒素在CKD-BD 中的作用尚不明確。本研究于2021 年1 月至2022 年4 月通過(guò)構(gòu)建CKD-BD 大鼠模型，借助超高效液相色譜-質(zhì)譜（UHPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)，了解CKD-BD 大鼠血清代謝組學(xué)變化，探索尿毒癥毒素在CKD-BD 發(fā)病中的作用，為CKD-BD 的臨床干預(yù)提供依據(jù)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑四環(huán)素（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)87128）、鈣黃綠素（美國(guó)Merck 公司，批號(hào)0875）、水合氯醛（中國(guó)國(guó)藥公司，批號(hào)H37022673）、Goldner's三色染色試劑盒（廣州三旭生物科技公司）、包埋樹脂液（德國(guó)Technovit公司）。純化鼠糧購(gòu)自廣州佰匯生物科技有限公司，大鼠全段甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）試劑盒購(gòu)自美國(guó)SAB公司。

1.1.2 主要儀器硬組織切片機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司，型號(hào)310CP）、磨片機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司，型號(hào)400CS）、光固化機(jī)（德國(guó)EXAKT 公司，型號(hào)E520）、熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號(hào)BX53）、超高效液相質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，型號(hào)Vanquish）、骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（美國(guó) Bioquant，型號(hào)BIOQUANT OSTEO）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16 只8 周齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量范圍為240～260 g，分籠飼養(yǎng)于24～28 ℃的環(huán)境中，每日更換墊料，自由攝食及飲水。

1.2 方法

1.2.1 骨代謝異常大鼠動(dòng)物模型建立通過(guò)高磷高腺嘌呤飲食誘導(dǎo)CKD-BD 大鼠，具體方法如下：所有大鼠經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組8 只：（1）健康對(duì)照組（NC 組）：使用普通大鼠飼料喂養(yǎng)90 d；（2）CKD-BD 組：采用高磷高腺嘌呤飼料（含1.8 % 磷及0.75 % 腺嘌呤）喂養(yǎng)60 d之后更換高磷飼料（含1.8%磷）喂養(yǎng)30 d 后處死。大鼠處死前15 d 及14 d 腹腔注射四環(huán)素（30 mg/kg），處死前3 d 及2 d 腹腔注射鈣黃綠素（5 mg/kg），四環(huán)素及鈣黃綠素注射液均為當(dāng)日配制且避光保存。水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈采血處死大鼠。離心后取血清置于-80 ℃冰箱分裝保存。分離大鼠右側(cè)股骨，中性福爾馬林固定。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)使用BeckmanAU 5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血鈣、磷、肌酐。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清全段PTH水平。

1.2.3 皮質(zhì)骨包埋及切片制備大鼠右側(cè)股骨標(biāo)本經(jīng)福爾馬林液固定48 h 后，行梯度酒精（70%，80%，95%）脫水，每步24 h。脫水后浸泡于Technovit 7200 樹脂液中，使用光固化機(jī)包埋聚合。固化后的組織塊用硬組織切片機(jī)切取厚度約200 μm的切片，并使用磨片機(jī)打磨至20 μm，最后以4 000目砂紙拋光。磨片根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Goldner's 三色染色：首先將磨片放入Weigert's 蘇木素液染色15 min，再用流動(dòng)水漂洗10 min，后使用酸性品紅－麗春紅染液染色5 min。使用1%冰醋酸洗2 次后用1%磷鉬酸染色，直到膠原脫色，再用1%冰醋酸洗2 次，2%亮綠液染色5 min，1%冰醋酸洗2 次，濾紙吸干，封片在顯微鏡下進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)。

1.2.4 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)染色后的切片進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)，按照國(guó)際通用的Frost標(biāo)準(zhǔn)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)方法對(duì)骨轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)態(tài)參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，以骨礦化沉積率（mineral apposition rate，MAR）反映新骨礦化速度，以骨形成率/骨體積（bone formation rate/bone volume，BFR/BV）反映骨轉(zhuǎn)換率。

1.2.5 大鼠血清代謝組學(xué)檢測(cè)通過(guò)UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)兩組大鼠血清代謝產(chǎn)物。色譜條件：使用Vanquish （Thermo Fisher Scientific）超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 mm×100 mm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L 氨水，B 相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL。質(zhì)譜條件：采用Orbitrap Exploris 120 質(zhì)譜儀進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。相關(guān)參數(shù)設(shè)定如下：毛細(xì)管電壓正、負(fù)離子條件下分別設(shè)定為3.8 kV 和-3.4 kV。鞘氣流速：50 Arb。輔助氣流速：50 Arb。毛細(xì)管溫度：320 ℃。分辨率為6 000進(jìn)行全掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法生化指標(biāo)及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料使用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用SIMCA軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：如主成分分析 （principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA）。利用京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)變化與NC 組大鼠相比，CKD-BD 組大鼠表現(xiàn)出肌酐升高、低血鈣、高血磷、高PTH的特點(diǎn)（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 造模后兩組大鼠血清生化指標(biāo)比較/

表1 造模后兩組大鼠血清生化指標(biāo)比較/

注：NC 為健康對(duì)照，CKD-BD 為慢性腎臟病骨代謝異常，PTH 為甲狀旁腺激素。

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2.2 各組大鼠骨組織形態(tài)變化通過(guò)四環(huán)素-鈣黃綠素活體熒光雙標(biāo)記對(duì)各組大鼠的骨組織形態(tài)進(jìn)行觀察，見(jiàn)圖1。黃色熒光為大鼠處死前第15 天和第14天注射四環(huán)素標(biāo)記的礦化帶，綠色熒光為大鼠處死前第3 天和第2 天注射鈣黃綠素標(biāo)記的礦化帶，黃色和綠色標(biāo)記間的區(qū)域，即該段時(shí)間的新生骨礦化區(qū)域（白色箭頭處為明顯的新骨礦化區(qū)域）。NC 組大鼠可見(jiàn)正常的成骨礦化帶，CKD-BD 組可見(jiàn)骨礦化帶增寬、礦化區(qū)域增多。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NC 組大鼠MAR 為（1.90±0.61）μm/d，CKD-BD組大鼠MAR 為（2.80±0.73）μm/d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.97，P=0.010）。NC 組大鼠BFR/BV 為（0.41±0.20）%/d，CKD-BD組大鼠BFR/BV為（1.25±0.41）%/d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.20，P＜0.001）。提示CKD-BD組大鼠骨轉(zhuǎn)換水平高于NC 組，呈現(xiàn)高骨轉(zhuǎn)換率、高新骨礦化速度的特點(diǎn)，與CKD-BD形態(tài)特征相符。

圖1 兩組大鼠骨組織形態(tài)變化（四環(huán)素-鈣黃綠素?zé)晒馊旧?00）：A為正常對(duì)照（NC）組大鼠，可見(jiàn)正常的成骨礦化帶；B為慢性腎臟病骨代謝異常（CKD-BD）組，可見(jiàn)骨礦化帶增寬，礦化區(qū)域增多

2.3 各組大鼠血清代謝譜PCA比較兩組大鼠血清樣本在正負(fù)離子下的總離子流，發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下，可獲得較強(qiáng)的化合物響應(yīng)和更為豐富的化合物信息，故后續(xù)采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。PCA 圖中的每一個(gè)符號(hào)點(diǎn)代表1 個(gè)血清樣品，各組樣品在空間分布位置不同，代表了不同組別樣本的代謝狀況不同。NC 組與CKD-BD 組的組間分離趨勢(shì)明顯，同組的樣本呈現(xiàn)聚集趨勢(shì)，提示樣本代謝產(chǎn)物在組間有明顯差異，同時(shí)組內(nèi)的穩(wěn)定性良好，見(jiàn)圖2。

2.4 OPLS-DA為進(jìn)一步比較組間差異變量，通過(guò)OPLS-DA分析方法對(duì)大鼠血清樣品進(jìn)行差異分析。圖中NC 組與CKD-BD 組分離顯著，提示CKD-BD 狀態(tài)下大鼠血清代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，見(jiàn)圖3。

2.5 兩組大鼠血清差異代謝物功能分析以P＜0.05，變量投影重要度大于1 為過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組間差異代謝物進(jìn)行篩選，在NC組與CKD-BD組大鼠間篩選到37 種差異代謝物。將差異產(chǎn)物的定量值進(jìn)行比較，以log2（fold change）表示差異的倍數(shù)關(guān)系，變化上調(diào)倍數(shù)前5名的物質(zhì)為：姜醇、丙酮酸、甲酚、硫酸甲酚、苯乙酰，變化下調(diào)倍數(shù)前5 名的物質(zhì)為：硬脂酸、辛葵烯酸、膽汁酸、α-亞麻酸、羥基吲哚乙酸。借助KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)以上差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行功能分析和通路富集。根據(jù)差異代謝物在KEGG代謝通路中的富集結(jié)果，計(jì)算Rich Factor（某一通路中注釋到的差異代謝物數(shù)量與該通路中所有代謝物數(shù)量的比值），該值越大表示富集程度越大。結(jié)果表明，兩組間差異代謝產(chǎn)物涉及甘油磷脂代謝、神經(jīng)傳導(dǎo)、自噬、糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成、膽汁分泌等生理過(guò)程。差異豐度得分可以反映出某一通路中所有差異代謝物的總體變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，與NC 組相比，CKD-BD 組糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成等通路上調(diào)。自噬、膽汁酸合成分泌、膽固醇代謝、?；撬岷痛渭?jí)?；撬岽x、甘油磷脂代謝等通路下調(diào)（P＜0.05）。這其中，參與自噬通路的兩組間差異代謝產(chǎn)物為磷脂酰乙醇胺。

3 討論

CKD 病人隨著腎小球?yàn)V過(guò)率逐漸下降，尿毒癥毒素在體內(nèi)蓄積，由此產(chǎn)生一系列臨床癥狀及并發(fā)癥［6］。研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥毒素與CKD 病人食欲下降、惡心嘔吐等消化道癥狀相關(guān)［5］。另有研究證實(shí)，尿毒癥毒素參與了CKD病人血管并發(fā)癥的發(fā)生［7］。此外還有研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥毒素影響了CKD 病人全身炎癥狀態(tài)［8］。CKD-BD 是CKD 常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。CKD-BD 早期臨床表現(xiàn)較為不典型，隨著疾病進(jìn)展逐漸出現(xiàn)骨痛、骨骼變形等晚期癥狀［9-10］。已有研究發(fā)現(xiàn)，腸道來(lái)源的尿毒癥毒素硫酸吲哚酚可通過(guò)抑制成骨細(xì)胞活性、誘導(dǎo)骨骼對(duì)PTH的抵抗等機(jī)制參與CKD-BD發(fā)生［11］。我們的研究中，發(fā)現(xiàn)CKD-BD 大鼠與NC 大鼠相比，血清代謝產(chǎn)物譜發(fā)生明顯變化。經(jīng)過(guò)功能分析，發(fā)現(xiàn)異常的代謝產(chǎn)物涉及甘油磷脂代謝、神經(jīng)傳導(dǎo)、自噬、糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成等生理過(guò)程。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白是真核生物細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜錨定的重要結(jié)構(gòu)，參與了細(xì)胞與外界信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，CKD-BD 組糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成通路上調(diào)，提示在慢性腎衰竭的環(huán)境下，細(xì)胞與外界信息傳遞更為復(fù)雜。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)與NC 組大鼠相比，CKD-BD組大鼠血清中與自噬相關(guān)的代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。自噬是真核細(xì)胞在基因調(diào)控下利用溶酶體降解自身細(xì)胞質(zhì)蛋白和受損細(xì)胞器的過(guò)程，可防止細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下存活，并對(duì)細(xì)胞毒性刺激作出反應(yīng)［15-17］。研究證實(shí)在低氧、炎癥等病理?xiàng)l件下，影響骨代謝水平的重要細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)增強(qiáng)自噬作用改善骨代謝狀態(tài)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)CKD-BD 組與自噬相關(guān)的代謝產(chǎn)物磷脂酰乙醇胺表達(dá)低于NC 組，研究證實(shí)磷脂酰乙醇胺低表達(dá)可影響自噬溶酶體的形成，引起自噬相關(guān)通路下調(diào)［19］，這提示自噬水平下降是CKD 環(huán)境下骨代謝異常的機(jī)制之一。此外既往研究發(fā)現(xiàn)，?；撬峥赏ㄟ^(guò)ERK1/2 信號(hào)途徑刺激成骨細(xì)胞的增殖和分化，且?；撬峥赏ㄟ^(guò)激活自噬減少骨量丟失，起到骨保護(hù)作用［20-21］。本研究中，牛磺酸代謝途徑在CKD-BD 組下調(diào)，提示CKD 病人?；撬岽x異?？赡軈⑴c了CKD-BD 的發(fā)展，進(jìn)一步研究可關(guān)注外源性補(bǔ)充食物或藥物等物質(zhì)對(duì)CKD骨骼的保護(hù)作用。

綜上所述，通過(guò)UHPLC-MS 技術(shù)比較CKD-BD大鼠與正常大鼠血清代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)兩者發(fā)生明顯變化。CKD-BD 組大鼠血清中與細(xì)胞間信號(hào)傳遞的信號(hào)通路上調(diào)，提示CKD 狀態(tài)下細(xì)胞信息傳遞更為復(fù)雜。同時(shí)與自噬相關(guān)的代謝通路下調(diào)，可能是影響機(jī)體骨代謝水平、導(dǎo)致CKD-BD發(fā)生的機(jī)制之一。

（本文圖1見(jiàn)插圖3-5）