鄭桂華，金曉霞，陶玉梅，劉丹陽(yáng)，朱興華，衛(wèi)穎澤

作者單位：1南通市腫瘤醫(yī)院/南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，江蘇 南通 226361；2南通市婦幼保健院病理科，江蘇 南通 226007；3復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科，上海 200090

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均位于女性惡性腫瘤第四位，2020 年全球新發(fā)病例和死亡病例大約分別為604 127例和341 831例［1］。在我國(guó)，宮頸癌的發(fā)病率和病死率均位于女性惡性腫瘤的前十位，分別是第六位和第七位［2］。組織病理學(xué)上宮頸癌主要分為兩大類：起源于鱗狀細(xì)胞的鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和起源于腺細(xì)胞的腺癌。SCC 約占宮頸癌的80%，一般由良性細(xì)胞不典型增生到宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical inepithial neoplasm，CIN）發(fā)展而來(lái)［3］。

核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一系列細(xì)胞保護(hù)基因的主要調(diào)節(jié)因子，能夠在應(yīng)激條件比如活性氧和親電試劑等情況下保護(hù)細(xì)胞［4］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明Nrf2 在多種癌中過(guò)表達(dá)，并且發(fā)揮著重要的促癌作用［5］。已有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2不僅在宮頸癌中發(fā)揮著重要的作用［6-7］，而且與正常宮頸鱗狀上皮相比，Nrf2 和其下游基因醌NADH 脫氫酶1（NQO1）在宮頸SCC 表達(dá)最高，CIN 次之［8］，這一結(jié)果表明Nrf2 在正常鱗狀上皮至SCC 發(fā)生過(guò)程中的作用。選擇性自噬接頭蛋白p62/Sequestosome1（SQSTM1）含有多種結(jié)構(gòu)域，能夠與包括有絲分裂原活化蛋白激酶激酶（MEKK）3，人BRCA1基因1相鄰蛋白（Nbr1），受體相互作用蛋白（RIP）1，人哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（Raptor），腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）6，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3，Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1），泛素等分子結(jié)合，從而影響炎癥、Nrf2、mTORC1、核因子-κB（NF-κB）等不同的信號(hào)通路。近年來(lái)，同樣有越來(lái)越多的研究表明p62在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并且發(fā)揮促癌的作用［9］。然而，Nrf2 與p62 在宮頸癌和上皮內(nèi)病變?cè)\斷中的價(jià)值尚未有研究報(bào)道，在宮頸不同病變中二者之間的相關(guān)性尚不明確。因此，在本研究中我們首先檢測(cè)了Nrf2 和p62 在宮頸癌和上皮內(nèi)病變中的表達(dá)情況并分析二者的相關(guān)性，最終評(píng)價(jià)其在宮頸癌和上皮內(nèi)病變中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2008 年1 月至2021 年12 月南通市腫瘤醫(yī)院病理科120 例宮頸SCC、102 例低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）和101 例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）病人及49 例宮頸良性/反應(yīng)性鱗狀上皮病人的石蠟標(biāo)本。本研究數(shù)據(jù)的使用已獲得病人或其近親屬及健康體檢者本人的知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑小單克隆抗體Nrf2（1∶200，AB62352）購(gòu)自abcam 公司，p62（1∶200，88588S）購(gòu)自CST 公司，一抗稀釋液和磷酸緩沖鹽溶液（PBS）均購(gòu)自北京中杉金橋公司，二抗和顯影液購(gòu)自Dako公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法將4 μm 厚的石蠟切片置于65 ℃溫箱中過(guò)夜，二甲苯常規(guī)脫蠟，依次經(jīng)100%、95%、85%、75%乙醇去除多余液體，蒸餾水沖洗后，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復(fù)液（pH 9.0）經(jīng)高壓修復(fù)，滴加一抗，室溫下孵育1.5 h，滴加二抗，37 ℃溫箱中孵育1 h，3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。為證明Nrf2和p62抗體免疫組織化學(xué)檢測(cè)的特異性，我們?cè)O(shè)置了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判讀由兩名病理科副主任分別閱片并記錄結(jié)果。Nrf2 和p62 以細(xì)胞質(zhì)中呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度計(jì)分［10］：無(wú)著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：＜5%為1 分，5%～30%為2 分，＞30%～60%為3 分，＞60%為4 分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘： 0 分為陰性（-），1～2 分為低表達(dá)（+），3～6 分為中等表達(dá)（++），＞6分為高表達(dá)（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用χ2檢驗(yàn)比較各組間Nrf2 和p62 的表達(dá)，計(jì)數(shù)資料以例表示，采用Spearman 秩相關(guān)分析各組間Nrf2和p62 之間的相關(guān)性，采用二元logistic 回歸分析和受試者操作特征曲線（ROC曲線）判斷Nrf2和p62在各組間的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的表達(dá)Nrf2和p62 在宮頸不同病變中均定位于細(xì)胞質(zhì)。Nrf2 和p62 在良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮中的表達(dá)低于LSIL、HSIL 與SCC（Nrf2χ2分別為30.74、41.31、129.15；p62χ2分別為29.93、30.64、159.27。均P＜0.05），并且Nrf2 和p62 在LSIL 中的表達(dá)明顯低于HSIL 與SCC（Nrf2χ2分別為126.71、176.49；p62χ2分別為101.14、60.02。均P＜0.05）。雖然p62 在HSIL 中表達(dá)低于SCC（χ2為126.93，P＜0.05），但是Nrf2在HSIL中表達(dá)高于SCC（χ2為161.64，P＜0.05）。見(jiàn)圖1；表1。

表1 核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）和p62在宮頸不同病變中的表達(dá)情況比較/例

圖1 良性/反應(yīng)性鱗狀上皮、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)等宮頸不同病變中的HE形態(tài)（HE染色×200）及核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）與p62表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色×200）

2.2 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的相關(guān)性Nrf2 和p62 在良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL和SCC中均呈正相關(guān)性（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）和p62在宮頸不同病變中的相關(guān)性/例

2.3 Nrf2 和p62 在宮頸不同病變中的診斷效能ROC曲線分析表明，除Nrf2在診斷HSIL與SCC中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，Nrf2、p62 以及聯(lián)合Nrf2 和p62在診斷良性/反應(yīng)性鱗狀上皮與LSIL、良性/反應(yīng)性鱗狀上皮與HSIL、良性/反應(yīng)性鱗狀上皮與SCC、LSIL 與HSIL、LSIL 與SCC、HSIL 與SCC 各個(gè)組別中均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與單獨(dú)使用Nrf2或者p62 相比，二者聯(lián)合鑒別這些宮頸病變效果更佳。見(jiàn)表3。

表3 核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）及p62在診斷宮頸不同病變中的ROC曲線結(jié)果

3 討論

宮頸癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而且近年來(lái)我國(guó)宮頸癌的發(fā)病年齡明顯年輕化［11］。宮頸LSIL 和HSIL 進(jìn)展為SCC 的概率分別為1%和20%～40%［12-13］，目前，除了人乳頭瘤病毒（HPV）基因分型和p16INK4a基因以外，很少有其他分子標(biāo)記在宮頸癌及癌前病變中被廣泛應(yīng)用。然而，p16INK4a陽(yáng)性也不是作為判斷HSIL的絕對(duì)指征，因此尋找更多的分子標(biāo)記用于輔助診斷宮頸癌及癌前病變至關(guān)重要，從而避免育齡婦女可能增加流產(chǎn)或早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的不必要的外科治療。

Nrf2最初被認(rèn)為是預(yù)防癌癥和其他疾病的化學(xué)預(yù)防化合物，隨后諸多研究表明Nrf2 不僅是多種癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移及抗藥性的驅(qū)動(dòng)因子，而且還具有調(diào)節(jié)代謝和其他基本細(xì)胞功能方面的新作用［14］。已有研究表明Nrf2在宮頸癌中的促癌作用。在維吾爾族女性中，宮頸SCC和CIN與Nrf2表達(dá)升高及Keap1表達(dá)降低有關(guān)。Nrf2 與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈正相關(guān)，而Keap1和這些指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。Nrf2促進(jìn)宮頸SCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且抑制細(xì)胞凋亡。Nrf2有望成為宮頸癌病人預(yù)后差的指標(biāo)［6］。Nrf2 和其下游分子NQO1 及血紅素氧化酶-1（HO1）在宮頸腫瘤組織中不同程度地表達(dá)增高。在宮頸癌細(xì)胞CaSki 細(xì)胞中敲除Nrf2，其下游基因表達(dá)明顯降低，并且促進(jìn)了化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。除此之外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)順鉑聯(lián)合Nrf2 敲除進(jìn)一步抑制了腫瘤的生長(zhǎng)［7］。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)與良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮相比，Nrf2 在宮頸SCC 中過(guò)表達(dá)。并且Nrf2 能夠有效地鑒別良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮和LSIL 或LSIL 和HSIL。值得注意的是，Nrf2 在SCC 和HSIL 表達(dá)均高于良性/反應(yīng)性宮頸和LSIL，但是在SCC 中Nrf2 的表達(dá)略低于HSIL，具體原因還有待在今后的研究中發(fā)現(xiàn)。

許多文獻(xiàn)表明Nrf2和p62之間存在一個(gè)正反饋環(huán)。p62 堆積能夠激活Nrf2 和其下游靶向基因，而Nrf2 也可以直接與p62 啟動(dòng)子區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）序列結(jié)合調(diào)節(jié)p62 的表達(dá)［15-16］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)敲減p62 后，宮頸癌細(xì)胞活力明顯下降、凋亡增加，活性氧產(chǎn)生。而且在宮頸癌細(xì)胞中敲除p62 后，Nrf2 表達(dá)水平明顯下降［17］，細(xì)胞水平證實(shí)二者具有相關(guān)性。目前Nrf2 和p62 在宮頸組織中的相關(guān)性尚不明確，本研究發(fā)現(xiàn)Nrf2 和p62 在良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL 和SCC 中均具有正相關(guān)性，我們?cè)诮M織水平進(jìn)一步證實(shí)了Nrf2 和p62 具有相關(guān)性。Nrf2 和p62 的相關(guān)性不僅在宮頸組織中得到證實(shí)，我們?cè)缙诰驮谌橄侔┘?xì)胞和組織中發(fā)現(xiàn)Nrf2和p62能夠相互調(diào)節(jié)并具有正相關(guān)性，誘導(dǎo)乳腺癌耐藥［10］。在肝細(xì)胞肝癌和胰腺導(dǎo)管腺癌中也同樣證實(shí)了Nrf2和p62之間具有相關(guān)性，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［18-19］。

p62 作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，不僅協(xié)調(diào)癌細(xì)胞的代謝重編，而且還調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)正常細(xì)胞的功能，以支持腫瘤生長(zhǎng)和增殖。越來(lái)越多的證據(jù)表明，p62 在各種癌癥中都有異常表達(dá)，如肺癌、肝癌、腎癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等［20-21］。梁冠男等［22］研究發(fā)現(xiàn)p62在宮頸浸潤(rùn)性癌、CINⅡ/Ⅲ、CINⅠ、正常宮頸表達(dá)均不相同，且隨病情的加重表達(dá)量會(huì)隨之增加，我們的結(jié)果與其一致。本研究同樣發(fā)現(xiàn)p62在良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮中表達(dá)最低，其次是LSIL、HSIL，在SCC 中表達(dá)最高。而且通過(guò)ROC 曲線分析顯示p62 能夠有效地鑒別良性/反應(yīng)性宮頸鱗狀上皮、LSIL、HSIL 及SCC。與單獨(dú)使用Nrf2 或者p62 時(shí)相比，二者聯(lián)合使用鑒別這些不同的宮頸病變效果更佳。

綜上所述，Nrf2 和p62 在不同宮頸病變中表達(dá)各不相同，良性/反應(yīng)性鱗狀上皮中不表達(dá)或低表達(dá)，在LSIL 中表達(dá)有所增高，HSIL 和SCC 中表達(dá)最高，且二者在不同宮頸病變中均具有正相關(guān)性，單獨(dú)使用或者二者聯(lián)用均能夠有效診斷不同的宮頸病變。Nrf2 和p62 有望成為像p16INK4a 一樣作為臨床診斷宮頸病變的分子標(biāo)記。

（本文圖1見(jiàn)插圖3-5）