張艷慧，付萍萍，汪安，張明童，王楠，李家港

作者單位：1保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定 071000；2池州市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，安徽 池州 247100；3甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院（甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），甘肅 蘭州 730070

酸棗仁收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，來(lái)源為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟種子［1］，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝，寧心安神，斂汗，生津的功效［2］。近年來(lái)酸棗仁藥材資源緊缺，價(jià)格昂貴，質(zhì)量參差不齊，摻偽現(xiàn)象頻發(fā)。比較常見(jiàn)的有同科植物滇刺棗Ziziphus.mauritianaLam.的成熟種子，以滇棗仁、緬棗仁或理?xiàng)椚手斐渌釛椚剩?］。目前關(guān)于二者的摻偽研究很少，中國(guó)食品藥品檢定研究院劉薇等［4］在中藥酸棗仁的真?zhèn)舞b別方法研究中報(bào)道過(guò)，酸棗仁與理?xiàng)椚试诨瘜W(xué)成分上有明顯的差異，但未指出具體的化學(xué)成分。查閱相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］，成功提取出6'''-芥子酰斯皮諾素，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其含量，該成分在酸棗仁與理?xiàng)椚仕幉闹械暮看嬖诤艽蟮牟町悾摲椒`敏度高、準(zhǔn)確度好且易于推廣，可有效解決酸棗仁摻偽理?xiàng)椚实膯?wèn)題。本研究起止時(shí)間為2020年12月至2022年12月。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-2010A 高效液相色譜儀（日本島津公司），BP211D 型電子天平（精度為萬(wàn)分之一）［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，索式提取器（天津市北方玻璃儀器）。

1.2 試劑、試藥6'''-芥子酰斯皮諾素對(duì)照品（第三方公司提純，含量以94.8%計(jì)）；乙腈（默克化工技術(shù)（上海）有限公司，批號(hào)11166230132）為色譜純，水（高碑店娃哈哈宏振食品飲料有限公司，批號(hào)3119GH）為超純水，其他試劑均為分析純；酸棗仁藥材（10 批次），理?xiàng)椚仕幉模?0 批次），經(jīng)河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院段吉平主任藥師鑒定，見(jiàn)表1。

表1 酸棗仁和理?xiàng)椚仕幉臉悠沸畔?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；對(duì)照品溶液進(jìn)樣量：10 μL，供試品溶液進(jìn)樣量：20 μL；理論塔板數(shù)均不低于2 000。

表2 梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 毫升含0.231 6 mg 的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3 毫升至10 毫升量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩），精密稱(chēng)取2 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）80 mL，回流4 h，棄去石油醚液，藥渣揮去溶劑，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，回流2 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，加70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液［7］。

2.3 方法學(xué)考察線(xiàn)性關(guān)系考察：取對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得6 個(gè)質(zhì)量濃度水平的對(duì)照品稀釋液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程Y=187 507X+17 896，線(xiàn)性范圍為2.32～138.96 μg/L，相關(guān)系數(shù)（r）=1，表明方法線(xiàn)性關(guān)系良好［8］。

精密度試驗(yàn)：精密吸取“2.2”項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次測(cè)定，結(jié)果峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好［9］。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批次為L(zhǎng)9，S4）樣品各6份，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果含量的RSD分別為1.51%、1.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好［10］。

定量限（LOQ）和檢測(cè)限（LOD）：將“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)⒁来芜M(jìn)樣測(cè)定。按信噪比（S/N）=10 計(jì)算，該方法測(cè)定6'''-芥子酰斯皮諾素的定量限為2.08 μg/L；按S/N=3計(jì)算，該方法測(cè)定6'''-芥子酰斯皮諾素的檢測(cè)限為0.69 μg/L。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：將供試品溶液（批次為L(zhǎng)9，S4）在0、1、2、4、8、16、24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD 為0.26%、0.33%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定［11］。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密稱(chēng)取已知含量的理?xiàng)椚屎退釛椚剩ㄅ蜭9、S4）（過(guò)四號(hào)篩）1 g，分成兩組，每組6 份，分別精密加入定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算6'''-芥子酰斯皮諾素的加樣回收率［12］。理?xiàng)椚驶厥赵囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，酸棗仁回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 理?xiàng)椚?'''-芥子酰斯皮諾素回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表4 酸棗仁6'''-芥子酰斯皮諾素回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定（1）取不同批次酸棗仁（S1～S10）及理?xiàng)椚剩↙1～L10）樣品各2.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 酸棗仁和理?xiàng)椚蕵悠窚y(cè)定6'''-芥子酰斯皮諾素結(jié)果/%

（2）取不同批次酸棗仁（S1～S10）分別加入理?xiàng)椚剩↙9），理?xiàng)椚收伎傎|(zhì)量的3%，取上述10份樣品各2.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 酸棗仁3%摻偽樣品（理?xiàng)椚剩?0份測(cè)定6'''-芥子酰斯皮諾素結(jié)果/%

3 討論

3.1 提取方法的選擇本方法是在《中國(guó)藥典》2020 年版一部酸棗仁含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上加以改善而成。該方法通過(guò)定量加入70%乙醇，定量吸取濾液，可有效避免供試品溶液的損失，且該方法更簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、回收率高。

3.2 選取“酸棗仁3%摻偽樣品”作為判定依據(jù)的理由《中國(guó)藥典》2020 年版四部 0212 藥材和飲片檢定通則規(guī)定：除另有規(guī)定外，飲片中藥屑及雜質(zhì)通常不得過(guò)3%，故選取“酸棗仁3%摻偽樣品”作為判定依據(jù)。

3.3 耐用性試驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2020 年版四部9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求，對(duì)方法的耐用性進(jìn)行考察。首先，選用了3種品牌的色譜柱，分別為Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、ShimNex CS C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），結(jié)果不同色譜柱測(cè)定的6'''-芥子酰斯皮諾素含量差異不大，RSD＜2.0%。其次，選取了3 個(gè)品牌的高效液相色譜儀，分別為島津2010AHT、Agilent1260、Waters2695，結(jié)果不同儀器測(cè)得數(shù)據(jù)的RSD＜1.5%。同時(shí)檢測(cè)不同柱溫，不同流量，不同流動(dòng)相比例，結(jié)果試驗(yàn)中測(cè)得的數(shù)據(jù)RSD＜2.0%［13］。

3.4 樣品收集本次實(shí)驗(yàn)共收集到酸棗仁樣品10批次［14］，產(chǎn)地覆蓋東北、河北、山東、山西、陜西、甘肅等幾大產(chǎn)區(qū)；理?xiàng)椚蕵悠?0次，經(jīng)市場(chǎng)調(diào)研，目前理?xiàng)椚蕵悠窞樵侥线M(jìn)口品種，為了保證所用樣品具有代表性，分批次從不同商戶(hù)手中購(gòu)買(mǎi)。

3.5 結(jié)果判定經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在酸棗仁中含量范圍為0.003 3%～0.005 1%，在理?xiàng)椚手泻糠秶鸀?.050 6%～0.066 0%，3%摻偽樣品中含量范圍為0.005 0%～0.007 2%。由上述數(shù)據(jù)可判定，當(dāng)樣品含量高于0.007 2%時(shí)，即可判定酸棗仁樣品中摻有理?xiàng)椚省?/p>

3.6 方法評(píng)價(jià)改進(jìn)方法操作簡(jiǎn)單［15］，樣品前處理方便，準(zhǔn)確性好，回收率高，可靠性強(qiáng)，成功率高，對(duì)酸棗仁的質(zhì)量控制［16］具有一定科學(xué)價(jià)值，經(jīng)初步研究，此方法可適用于膠囊劑中酸棗仁藥材的摻偽鑒別，為中成藥中酸棗仁摻偽鑒別奠定科學(xué)依據(jù)［17］。