嚴(yán)緒華，梅格格，梅凌，方振峰

作者單位：1武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學(xué)部，湖北 武漢 430010；2江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北 武漢 430056

原發(fā)性肝癌，簡(jiǎn)稱為“肝癌”，因其具有較高的發(fā)病率和病死率，已成為我國(guó)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一［1］。從病理學(xué)類(lèi)型上肝癌可劃分為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝細(xì)胞癌-膽管癌（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA），三者差異較大，其中HCC 占75%～85%，在我國(guó)肝癌病人中比較常見(jiàn)［2］。目前，對(duì)肝癌的治療普遍存在復(fù)發(fā)概率高、手術(shù)困難、肝源缺乏、預(yù)后較差等問(wèn)題［3］。中醫(yī)藥作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)已存在幾千年，其在腫瘤治療方面有自己獨(dú)特之處?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)部分中藥可通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、提高免疫力和調(diào)節(jié)信息通路等來(lái)達(dá)到預(yù)防或治療肝癌的目的［4］。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找抗癌活性成分引起了科研工作者的廣泛興趣［5-10］。

半枝蓮，民間又稱為狹葉韓信草（廣州植物志），水韓信（廣西藥用植物圖志）等［11］，為唇形科（Labiatae）植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don的干燥全草，多年生草本植物，常見(jiàn)于田邊溝渠或濕潤(rùn)的草地，國(guó)內(nèi)主產(chǎn)于河北、山東、陜西南部、河南、江蘇、浙江等地區(qū)［12］。半枝蓮作為一種常見(jiàn)的抗癌作用的中藥，其單味藥或復(fù)方用藥常用于治療胃癌、乳腺癌、肝癌等［10-11，13］。半枝蓮在抗腫瘤方面的研究主要集中在黃酮類(lèi)成分［14-17］以及多糖類(lèi)成分［18-20］，但近幾年，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其二萜類(lèi)成分（包括二萜生物堿類(lèi)）也具有較好的抗腫瘤作用［21］，這引起了人們對(duì)半枝蓮中二萜類(lèi)化合物的興趣。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)半枝蓮生物堿富集部分（主要為二萜及二萜生物堿類(lèi)化合物）表現(xiàn)出較明顯的抗HepG2 肝癌細(xì)胞毒活性［22］，同時(shí)，嚴(yán)威［23］報(bào)道了5 個(gè)半枝蓮二萜類(lèi)化合物能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞HepG2/ADR（阿霉素耐藥株）多藥耐藥活性。但目前對(duì)半枝蓮二萜類(lèi)化合物抗肝癌作用機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。有鑒于此，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接聯(lián)用的方法探討半枝蓮二萜類(lèi)化合物抗肝癌可能的潛在靶點(diǎn)和通路，為進(jìn)一步深入研究二萜類(lèi)化合物抗肝癌相關(guān)作用機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 半枝蓮二萜活性成分的篩選利用scifinder數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Scutellaria barbata”為關(guān)鍵詞進(jìn)行主題搜索（1987 年1 月至2022 年7 月），從所檢索出的文獻(xiàn)中獲取半枝蓮二萜類(lèi)化合物（包含二萜生物堿類(lèi)化合物）。使用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）對(duì)所得化合物進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)于未收錄的化合物用ChenDraw 進(jìn)行繪制，所有化合物結(jié)構(gòu)均以sdf 格式文件保存。利用SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)［24］（http：//www.swissadme.ch/）預(yù)測(cè)化合物的生物利用度及類(lèi)藥性。設(shè)定胃腸道吸收為“高”結(jié)果作為藥物可以被吸收的條件，用于篩選具有較好口服生物利用度的活性化合物；設(shè)定5 種類(lèi)藥性（ Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge） 預(yù)結(jié)果中有2 個(gè)及2 個(gè)以上為“是”的化合物，即可作為活性化合物。

1.2 半枝蓮二萜活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)在Swiss 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)［25］（http：//www.swisstargetprediction.ch）中依次導(dǎo)入sdf格式的半枝蓮二萜活性化合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。物種參數(shù)設(shè)置為“智人”，以可能性（Probability）大于0 為條件，得到相關(guān)的靶點(diǎn)信息。選擇每個(gè)活性化合物可能性最高的20 個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)。再利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/uploadlists/），設(shè)置物種為“human”，將預(yù)測(cè)的靶標(biāo)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為所對(duì)應(yīng)的基因名。

1.3 肝癌疾病靶點(diǎn)的獲取利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.pharmgkb.org/）、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）、The Cancer Genome Atlas（TGCA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“l(fā)iver cancer”“HCC”為關(guān)鍵詞篩選疾病靶點(diǎn)，設(shè)置物種為“智人”，將7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的結(jié)果進(jìn)行整理，并去掉重復(fù)靶點(diǎn)，得到最終疾病靶點(diǎn)。

1.4 半枝蓮二萜“活性成分-抗肝癌靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用在線作圖工具VENNY 2.1（http：//www.liuxiaoyuyuan.cn/）對(duì)半枝蓮二萜活性成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和肝癌疾病靶點(diǎn)取交集，得到半枝蓮二萜治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)。將半枝蓮二萜活性成分和交集靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件［26］，構(gòu)建半枝蓮二萜“活性成分-抗肝癌靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行美化。根據(jù)度值篩選出核心半枝蓮二萜活性化合物。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選將“1.4”項(xiàng)中得到的半枝蓮二萜治療肝癌的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/），物種設(shè)定為“智人”，將最低相互作用分值設(shè)為 “highest confidence（0.900）”，在“網(wǎng)絡(luò)顯示選項(xiàng)”里選擇隱藏沒(méi)有相互作用聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)設(shè)置保持不變，得到PPI關(guān)系，導(dǎo)出相應(yīng)的相互關(guān)系數(shù)據(jù)文件到 Cytoscape中進(jìn)行可視化分析并進(jìn)行美化；利用cytoHubba 插件篩選出評(píng)分前10 的核心靶點(diǎn)，繪制核心靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因本體（GO）富集分析和KEGG 通路分析利用R 語(yǔ)言將核心靶點(diǎn)基因轉(zhuǎn)換成基因ID，并利用相應(yīng)的軟件包對(duì)基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，將P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.7 分子對(duì)接將篩選出的半枝蓮二萜活性化合物用ChemDraw 軟件繪制成3D 結(jié)構(gòu)，同時(shí)在PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.pdbus.org/）中找出篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并用Pymol 軟件將蛋白晶體進(jìn)行處理，分離出各自的原始配體。使用Autodock Tool 軟件對(duì)活性成分、靶點(diǎn)蛋白晶體結(jié)構(gòu)、原始配體進(jìn)行處理，各自保存為pdbqt 格式；找出靶點(diǎn)蛋白和原始配體的“grid box”，作為活性口袋，并進(jìn)行原始配體對(duì)接驗(yàn)證。使用Autodock Vina 1.1.2［27］進(jìn)行靶蛋白和活性成分之間的對(duì)接，選取合適的構(gòu)象，使用Pymol 軟件對(duì)各關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮二萜活性成分的篩選通過(guò)Scifinder數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，共獲得155 個(gè)半枝蓮二萜類(lèi)化合物（表1）。利用SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物的生物利用度及類(lèi)藥性預(yù)測(cè)，同時(shí)取胃腸道吸收為“高”作為藥物可被吸收的條件，共獲得符合條件的93個(gè)半枝蓮二萜類(lèi)化合物。

表1 半枝蓮二萜類(lèi)化合物SwissADME及SwissTargetPrediction 篩選結(jié)果

2.2 半枝蓮二萜活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)將上述符合生物利用度及類(lèi)藥性預(yù)測(cè)的半枝蓮二萜類(lèi)化合物分別導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)活性成分的靶點(diǎn)，根據(jù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的可能性（大于0），最終得到65 個(gè)活性化合物（見(jiàn)表1），取每個(gè)活性化合物預(yù)測(cè)可能性最高的20 個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)，最終得到363個(gè)基因靶點(diǎn)。

2.3 肝癌疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果在7 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中依據(jù)關(guān)鍵詞篩選疾病靶點(diǎn)，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)16 804 個(gè)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)173 個(gè)、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)295 個(gè)、TherapeuticTargetDatabase（TTD） 數(shù)據(jù)庫(kù)14個(gè)、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)193 個(gè)、TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)17 439個(gè)、GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO 登錄號(hào)：GSE84402）差異基因1 242個(gè)，整理后去掉重復(fù)靶點(diǎn)后得到20 546個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.4 “活性成分-靶點(diǎn)-肝癌”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用在線作圖工具對(duì)半枝蓮二萜活性成分的363個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和肝癌疾病的20 546 個(gè)靶點(diǎn)取交集，繪制Venn 圖，得到潛在作用靶點(diǎn)360 個(gè)。將交集靶點(diǎn)和65 個(gè)半枝蓮二萜活性成分導(dǎo)入cytoscape 軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-肝癌”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），包括426 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1734 條邊。度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，選取其中度值排名前5 的化合物作為半枝蓮二萜主要活性成分，分別為Scutebarbolide I（度值28）、Scutellone F（度值25）、Scutellone H（度值25）、Scutelinquanine D（度值25）、Scutebarbatine J（度值24）和Scutebata O（度值24）。

圖1 半枝蓮二萜“活性成分-靶點(diǎn)-肝癌”網(wǎng)絡(luò)

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選將半枝蓮二萜治療肝癌的360 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白相互作用圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出后用cytoscape進(jìn)行相應(yīng)處理，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2），包括264 個(gè)節(jié)點(diǎn)，981 條邊，其中度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色也越深；連接評(píng)分越高，邊越粗，顏色也越深。利用cytoHubba 插件進(jìn)行核心靶點(diǎn)的篩選，設(shè)置為以“Degree”值（度值）進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到評(píng)分排名前10 的靶點(diǎn)（表2），同時(shí)得到核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)可視圖（圖3），包括10 個(gè)節(jié)點(diǎn)，27 條邊，其中靶點(diǎn)顏色越深表示其越重要。從PPI 圖中可以看出，STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 這6 個(gè)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他靶點(diǎn)的相關(guān)性更明顯，關(guān)聯(lián)更密切，可能是半枝蓮二萜治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)和“2.4”項(xiàng)所得核心化合物之間直接關(guān)系不明顯，僅Scutelinquanine D 與MARPK1，Scutebarbatine J 與MARPK1、PIK3CA 有直接關(guān)系，因此，還需要通過(guò)分子對(duì)接來(lái)預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和核心化合物之間的是否有相互作用。

圖2 半枝蓮二萜治療肝癌的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 半枝蓮二萜治療肝癌的核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）圖

表2 半枝蓮二萜治療肝癌的核心靶點(diǎn)

2.6 GO 富集分析和KEGG 通路分析對(duì)篩選出的10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，共獲得953條P＜0.05 的GO 功能條目，其中766 條涉及生物過(guò)程、45條涉及細(xì)胞成分、142 條涉及分子功能，各選取排名前10 的條目繪制GO 功能氣泡分析圖，見(jiàn)圖4。從圖中可以看出，生物過(guò)程主要涉及肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、DNA 代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)輸入、DNA 代謝過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、鎘離子響應(yīng)、細(xì)胞器遺傳、高爾基遺傳等過(guò)程；細(xì)胞成分主要涉及囊腔、無(wú)花果素-1-富含顆粒管腔、無(wú)花果素-1-富含顆粒、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等；分子功能主要涉及磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白絲氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶結(jié)合等。

圖4 半枝蓮二萜治療肝癌核心靶點(diǎn)基因本體（GO）富集分析（前10）

對(duì)篩選出的10 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，設(shè)置P＜0.05，共獲得137 條富集通路，按照P值小且基因靶點(diǎn)數(shù)較多的原則篩選出前20條通路，并對(duì)其做通路富集氣泡圖，見(jiàn)圖5，包括癌癥中蛋白多糖、化學(xué)致癌受體激活、催乳素信號(hào)通路、癌癥程序性死亡受體配體1（PD-L1）表達(dá)和程序性死亡受體1（PD-1）檢查點(diǎn)通路、內(nèi)分泌抵抗、孕酮-介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟、FoxO 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、人巨細(xì)胞病毒感染、冠狀病毒病-新型冠狀病毒感染（COVID-19）、胰腺癌、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑抵抗等。

圖5 半枝蓮二萜治療肝癌的京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）通路富集分析

2.7 分子對(duì)接分子對(duì)接結(jié)果（表3）顯示，除了Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與PIK3R1 結(jié)合能大于-20.9 kJ/mol 外，核心活性化合物Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與關(guān)鍵靶點(diǎn)的最低結(jié)合能均低于-20.9 kJ/mol，表明核心活性化合物能與關(guān)鍵靶點(diǎn)有良好的結(jié)合力［28］，其中Scutebata O、Scutelinquanine D 與MAPK1 結(jié)合能強(qiáng)于其特異性配體CQ8，Scutebata O、Scutelinquanine D 與PIK3CA 結(jié)合能強(qiáng)于其特異性配體VBS，Scutebarbolide I 與MAPK3 結(jié)合能強(qiáng)于其特異性配體5ID。以上結(jié)果表明活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，尤其與MAPK1 和PIK3CA 兩靶點(diǎn)結(jié)合活性更強(qiáng)。化合物與靶點(diǎn)之間的相互作用見(jiàn)圖6，從圖中可知，MAPK1 主要是通過(guò)殘基ASP-104、ASN-152、SER-151、MET-106 中羰基以及ASP-109、ALA-33 中O 或N 原子與配體活潑H 之間形成氫鍵相結(jié)合；MAPK3 主要通過(guò)殘基ASP-184 中羰基以及CYS-183 中巰基與化合物Scutebarbolide I 中活潑氫形成氫鍵相結(jié)合；而PIK3CA主要通過(guò)殘基GLU-849中羰基和配體活潑氫形成氫鍵以及殘基SER-854中羥基氫與配體中羰基形成氫鍵相結(jié)合。

圖6 半枝蓮二萜主要活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

表3 半枝蓮二萜關(guān)鍵靶點(diǎn)和活性成分的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

肝癌是臨床上常見(jiàn)的一種惡性腫瘤疾病，可由多種病因造成，其中肝炎病毒的感染、化學(xué)致癌物質(zhì)是形成肝癌的主要誘因［29-30］。近些年，許多中藥在治療肝癌過(guò)程中療效明確，毒副作用較少，能有效地緩解肝癌相關(guān)并發(fā)癥，且能有效抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率［10］。半枝蓮作為傳統(tǒng)抗腫瘤中藥，在臨床上對(duì)肝癌有較好的療效［31-32］。近幾年，半枝蓮二萜類(lèi)化合物，包括二萜生物堿類(lèi)化合物對(duì)抗肝癌細(xì)胞毒活性的引起了人們的關(guān)注［22-23，33］，但其作用機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)半枝蓮相關(guān)研究文獻(xiàn)的檢索，得到半枝蓮二萜類(lèi)化合物，并通過(guò)SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到活性化合物65個(gè)，同時(shí)得到活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)363個(gè)；其與疾病靶點(diǎn)交集得到的360 個(gè)潛在靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，篩選得到10 個(gè)核心靶點(diǎn)，其中STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 為度值最高的6個(gè)靶點(diǎn)，它們和其他靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性明顯，可能為半枝蓮二萜治療肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明，STAT3 是一種關(guān)鍵的致癌轉(zhuǎn)錄因子，也是癌癥治療的有吸引力的靶標(biāo)［34］。STAT3 參與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，也促進(jìn)肝癌細(xì)胞抗凋亡及免疫逃逸，是傳染性病原體誘發(fā)肝癌發(fā)生的炎癥介質(zhì)，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［35］。MAPK1（又名細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2，ERK2）和MAPK3（又名細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1，ERK1）為MAPK 家族中ERK 成員。肝炎病人的肝內(nèi)細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、炎癥趨化因子等表達(dá)增加，會(huì)激活ERK 信號(hào)通路，使肝細(xì)胞異常增殖，誘發(fā)肝癌［36］。另外，有研究表明ERKl 可能是耐藥基因表達(dá)的上游調(diào)控元件，從而作為逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥性的分子靶點(diǎn)［37］。有研究表明，HSP90AA1 在丙型肝炎病毒（HCV）誘導(dǎo)的HCC中表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，可以作為檢測(cè)此類(lèi)HCC 進(jìn)展的生物標(biāo)志物［38］。PIK3R1（即P85 或P85-α）和PIK3CA［即磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-α 或P110-α］為PI3K家族中最經(jīng)典的IAPI3K。有研究證實(shí)，PI3K 的p85調(diào)節(jié)亞基在肝臟中起到生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和新型腫瘤抑制因子的作用，增加或恢復(fù)p85 的表達(dá)可能代表一種潛在癌癥治療可能性［39］；PIK3CA通過(guò)激活下游的蛋白激酶B（AKT）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生，因此，抑制PI3K/AKT/mTOR 通路可能成為肝癌治療的一個(gè)有效方法［40］。半枝蓮二萜類(lèi)成分可能是通過(guò)對(duì)上述多個(gè)靶點(diǎn)的信號(hào)調(diào)控達(dá)到治療肝癌的作用。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）包含VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3 三種亞型，其中VEGFR-2 直接參與血管生成，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和滲透，與腫瘤的增殖、侵襲性有關(guān)［41］。癌癥中蛋白多糖主要影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)和增殖作用?；瘜W(xué)致癌物質(zhì)是導(dǎo)致肝癌的重要因素，部分化學(xué)物質(zhì)通過(guò)與DNA 發(fā)生反應(yīng)改變遺傳信息從而在致癌過(guò)程中起啟動(dòng)的作用，部分通過(guò)增加細(xì)胞增殖而增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)［42］。腫瘤細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)PD-L1 的表達(dá)，能和PD-1 受體相結(jié)合，并進(jìn)一步激活T 細(xì)胞凋亡，從而通過(guò)抑制CD8+T 和CD4+T 細(xì)胞的活化開(kāi)啟逃避宿主細(xì)胞免疫監(jiān)視的功能［43］。人巨細(xì)胞病毒（CMV）初次感染人體后終身潛伏體內(nèi)，CMV 影響細(xì)胞的信號(hào)傳送和增殖的調(diào)控而誘導(dǎo)原癌基因的表達(dá)，使肝癌病人免疫功能降低而致使體內(nèi)潛伏感染的被激活而引起增殖性感染，增加了死亡風(fēng)險(xiǎn)［44］。GO 富集分析表明，半枝蓮二萜成分通過(guò)肽基-絲氨酸磷酸化、肽基-絲氨酸修飾、DNA 代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)輸入、DNA 代謝過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、鎘離子響應(yīng)等生物過(guò)程，囊腔、無(wú)花果素-1-富含顆粒管腔、無(wú)花果素-1-富含顆粒、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等細(xì)胞組成，磷酸酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白絲氨酸激酶活性和蛋白磷酸酶結(jié)合等分子功能治療肝癌。KEGG 通路富集結(jié)果表明半枝蓮二萜成分通過(guò)癌癥中蛋白多糖、化學(xué)致癌受體激活、催乳素信號(hào)通路、癌癥PD-L1 表達(dá)和PD-1 檢查點(diǎn)通路、內(nèi)分泌抵抗、孕酮-介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟、FoxO 信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗等信號(hào)通路治療肝癌。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，半枝蓮二萜成分中度值排名前5的活性成分Scutebarbolide I、Scutebata O、Scutelinquanine D、Scutellone F、Scutellone H 和Scutebarbatine J 與核心靶點(diǎn)STAT3、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1 和PIK3CA 有較好的結(jié)合位點(diǎn)，最低結(jié)合能在-17.6～-38.1 kJ/mol，主要以氫鍵結(jié)合力為主。其中化合物Scutebarbolide I、Scutelinquanine D、Scutebata O 和Scutebarbatine J 為二萜生物堿類(lèi)化合物，和靶點(diǎn)MAPK1、PIK3CA 結(jié)合力最好，部分化合物的最低結(jié)合能甚至超過(guò)靶點(diǎn)的特異性配體的最低結(jié)合能，提示半枝蓮二萜生物堿類(lèi)化合物可能在半枝蓮二萜治療肝癌中具有重要的地位，其作用可能和對(duì)MAPK1、PIK3CA靶點(diǎn)的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)探究了半枝蓮二萜類(lèi)化合物治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，表明半枝蓮二萜類(lèi)化合物治療肝癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多機(jī)制的特點(diǎn)，同時(shí)也表明半枝蓮二萜生物堿類(lèi)化合物在肝癌的治療中可能具有潛在的價(jià)值，為半枝蓮治療肝癌的深入研究提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

（本文圖1～3見(jiàn)插圖3-3，圖4～6見(jiàn)插圖3-4）