朱征全，王松，郭宏志，陳海洋

作者單位：南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院肝膽胰脾外科，河南 南陽(yáng) 473000

肝癌是臨床最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，常發(fā)于40 歲以上男性人群，以病情進(jìn)展快、預(yù)后不佳為主要特征，可并發(fā)自發(fā)性低血糖癥、肝性腦病、紅細(xì)胞增多癥、肝腎衰竭及其他伴癌重癥，危及病人生命安全，現(xiàn)已成為全球第二大癌癥相關(guān)致死性疾?。?］。臨床治療肝癌以根治性切除術(shù)為首選方案，配合放化療可顯著提升早期病人生存率，但對(duì)于中晚期病人來說，因其復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特點(diǎn)，治療效果并不理想［2］。重樓是常見中藥，具有清熱解毒、消腫止痛及涼肝定驚之功效，皂苷是其主要活性成分，主要苷元為薯蕷皂苷元（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ）及偏諾皂苷元（重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ）。重樓皂苷Ⅶ是判定中藥重樓質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、止血等多種藥理活性。以往研究多集中在重樓皂苷Ⅰ、Ⅵ上，關(guān)于重樓皂苷Ⅶ的研究較少。近年來有研究認(rèn)為，重樓皂苷Ⅶ可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤作用［3］。本研究于2021年6 月至2022 年6 月采用重樓皂苷Ⅶ干預(yù)肝癌細(xì)胞，觀察其對(duì)該細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系人肝癌HepG2細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物、主要試劑、儀器重樓皂苷Ⅶ（純度：99%）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號(hào)通路抑制劑SB203580（上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司），噻唑藍(lán)比色法試劑盒、膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）/碘化丙啶（PI）雙染凋亡檢測(cè)試劑盒［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，兔抗人p38MAPK、磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2）一抗［艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司］。

Synergy-HT 酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司），SZX16顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)取HepG2 細(xì)胞系在DMEM 高糖培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素），培養(yǎng)箱內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件（37 ℃，5%二氧化碳）下體外培養(yǎng)，每天半量更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至貼壁，胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 噻唑藍(lán)法檢測(cè)重樓皂苷Ⅶ細(xì)胞毒性取對(duì)數(shù)期HepG2 細(xì)胞，緩沖液清洗，胰酶消化、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升接種至96 孔板，待細(xì)胞融合至貼壁，分別加入終濃度為（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）的重樓皂苷Ⅶ DMEM 高糖混合培養(yǎng)液，48 h 后加入新備制噻唑藍(lán)溶液20 μL，2 h 后吸棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）后搖床振蕩至晶體完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)處吸光度［D（λ）490nm］，計(jì)算各干預(yù)孔細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-干預(yù)孔細(xì)胞D（λ）490nm/對(duì)照孔細(xì)胞D（λ）490nm）×100%，繪制折線圖計(jì)算重樓皂苷Ⅶ對(duì)HepG2 細(xì)胞的半抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）。

1.5 干預(yù)與分組取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，胰酶消化重懸，待其融合至貼壁，分為對(duì)照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580組、聯(lián)合組，對(duì)照組置于DMEM 高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，重樓皂苷Ⅶ組培養(yǎng)基內(nèi)加入重樓皂苷Ⅶ（終濃度0.8 μmol/L 溶于DMSO），SB203580 組培養(yǎng)基內(nèi)加入SB203580（終濃度10 μmol/L 溶于DMSO）［4］，聯(lián)合組培養(yǎng)基內(nèi)加入重樓皂苷Ⅶ（0.8 μmol/L）、SB203580（10 μmol/L）。干預(yù)48 h 用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.6 噻唑藍(lán)法檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖能力取干預(yù)后各組細(xì)胞，清洗、重懸、接種同“1.4”，加入完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)第24、48、72 h 加入新備制噻唑藍(lán)溶液，2 h后吸棄上清，加入DMSO 搖床振蕩，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各組細(xì)胞吸光度值。

1.7 Annexin Ⅴ/PI 雙染法檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡率取干預(yù)后各組細(xì)胞，清洗、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升接種至6孔板，DMEM 高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，48 h 后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，離心吸棄上清，binding buffer 液重懸并標(biāo)記細(xì)胞，加入AnnexinⅤ-FITC液染色，PI液雙染，冷藏避光孵育20 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移能力取干預(yù)后各組細(xì)胞，清洗、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升接種至6孔板，DMEM 高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，待貼壁后吸棄培養(yǎng)液，利用移液槍頭垂直均勻在板面沿孔中心畫出一直線劃痕，PBS沖洗掉邊緣細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。光鏡下拍照測(cè)量計(jì)算0 h及24 h 劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞遷移率=（1-24 h 劃痕面積/0 h劃痕面積）×100%。

1.9 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲能力人工基膜膠經(jīng)預(yù)冷無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，以40 微升/孔鋪于Transwell 小室底部，取干預(yù)后各組細(xì)胞，清洗、重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/毫升接種于小室中，下層加入完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），培養(yǎng)24 h 后取出杯底濾膜，PBS 沖洗，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，PBS 沖洗、風(fēng)干，置于光鏡下觀察，選取5 個(gè)不相鄰視野，拍照記錄侵襲細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝癌細(xì)胞p38 MAPK、pp38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)取干預(yù)后各組細(xì)胞，PBS 清洗，加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液裂解細(xì)胞，注入離心管內(nèi)，低溫離心15 min（10 000 r/min，r=10 cm），棄上清，BCA 法定量蛋白。取40 μg待測(cè)樣本，按1∶5體積比與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白電泳試劑混勻，金屬浴沸騰變性蛋白，電壓80 V 行上樣電泳分離，跑膠后濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，BSA 溶液封閉2 h，加入兔抗人p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2（稀釋濃度1∶500），4 ℃冷藏過夜，洗膜后加入二抗（稀釋濃度1∶2 000），室溫孵育2 h，常規(guī)洗膜、發(fā)光、顯影，經(jīng)成像分析儀分析各蛋白條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參蛋白，分析p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)水平，計(jì)算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)資料的分析、處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 25.0。計(jì)量資料以服從正態(tài)分布以表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)樣本資料采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各劑量重樓皂苷Ⅶ對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖抑制率經(jīng)終濃度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L）重樓皂苷Ⅶ干預(yù)后，其對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，IC50位于0.6～0.8 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.8 μmol/L 作為重樓皂苷Ⅶ干預(yù)劑量。詳情見圖1。

圖1 各劑量重樓皂苷Ⅶ對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率

2.2 各劑量SB203580 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖抑制率經(jīng)終濃度（1、2.5、5、10、20、40 μmol/L）SB203580干預(yù)后，其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，IC50位于5～10 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10 μmol/L作為SB203580干預(yù)劑量。見圖2。

圖2 各劑量SB203580對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制率

2.3 各組細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05），SB203580組24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅶ組比較，聯(lián)合組24、48、72 h 吸光度值升高（P＜0.05）；與SB203580 組比較，聯(lián)合組24、48、72 h 吸光度值降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞吸光度值D（λ）490 nm比較/

表1 各組HepG2細(xì)胞吸光度值D（λ）490 nm比較/

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與重樓皂苷Ⅶ組比較，P＜0.05。③與SB203580組比較，P＜0.05。

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2.4 各組細(xì)胞凋亡率對(duì)照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率分別為（3.25±0.78）% 、（39.87±8.94）% 、（1.05±0.15）% 、（11.30±2.80）%（F=72.38，P＜0.001）；與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組凋亡率升高，SB203580 組凋亡率降低（P＜0.05）；聯(lián)合組凋亡率低于重樓皂苷Ⅶ組，高于SB203580組（P＜0.05）。

2.5 各組細(xì)胞遷移能力對(duì)照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯(lián)合組細(xì)胞遷移率分別為（74.33±9.37）%、（11.21±3.35）%、（89.30±14.56）%、（40.52±8.18）%（F=64.78，P＜0.001）；與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組遷移率降低（P＜0.05），SB203580 組遷移率升高（P＜0.05）；聯(lián)合組遷移率高于重樓皂苷Ⅶ組，低于SB203580組（P＜0.05）。

2.6 各組細(xì)胞侵襲能力對(duì)照組、重樓皂苷Ⅶ組、SB203580 組、聯(lián)合組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（364.92±47.99）個(gè)、（54.84±7.41）個(gè)、（617.04±75.34）個(gè)、（141.36±16.75）個(gè)（F=152.25，P＜0.001）；與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），SB203580 組侵襲細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與比較，聯(lián)合組侵襲細(xì)胞數(shù)高于重樓皂苷Ⅶ組，低于SB203580組（P＜0.05）。

2.7 各組細(xì)胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2升高（P＜0.05），SB203580 組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅶ組比較，聯(lián)合組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 降低（P＜0.05）；與SB203580組比較，聯(lián)合組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高（P＜0.05）。見表2；圖3。

表2 各組HepG2細(xì)胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較/

表2 各組HepG2細(xì)胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2比較/

注：p-p38 MAPK 為磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶，p38 MAPK為p38 絲裂原活化蛋白激酶，p-ERK1/2 為磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2，ERK1/2為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與重樓皂苷Ⅶ組比較，P＜0.05。③與SB203580組比較，P＜0.05。

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圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量

3 討論

肝癌是源自肝細(xì)胞及肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的原發(fā)性癌癥，其發(fā)病可能與持續(xù)性肝損傷有關(guān)，乙型肝炎及丙型肝炎病毒感染、飲酒、吸煙、黃曲霉毒素及慢性代謝疾病均與其具有顯著相關(guān)性，大多數(shù)病人依次發(fā)展為肝炎、肝纖維化、肝硬化，最終發(fā)展為肝癌［5-7］。因早期缺乏特異性癥狀，超過60%的病人被確診時(shí)已處于晚期，此時(shí)肝癌細(xì)胞多已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，僅能采用放化療及免疫靶向藥物，但其高惡性的特點(diǎn)，極大縮短了病人生存期［8］。因此臨床上亟待開發(fā)抑制其高惡性的治療新藥物。中醫(yī)治療肝癌由來已久，具有減少放化療毒副作用、提升機(jī)體免疫、多效能、多靶點(diǎn)等多重優(yōu)勢(shì)。隨著現(xiàn)代提取工藝的進(jìn)步，從中藥中提取單體成分為肝癌治療帶來了新的希望。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組24、48、72 h 吸光度值，遷移率降低，凋亡率升高，侵襲細(xì)胞數(shù)減少，提示重樓皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)凋亡。中醫(yī)將肝癌歸屬于“肝積”“黃疸”“肝水”等癥范疇，主要病機(jī)為機(jī)體失和、病邪亂入，臟腑失調(diào)、氣血不通，或情志內(nèi)傷、宣發(fā)無(wú)門、肝氣郁結(jié)，橫逆犯脾、水不克化、日久生痰、痰瘀互搏、腫塊積聚、發(fā)為肝積，故治療應(yīng)以清肝去火、化瘀排毒為主［9-10］。重樓是中醫(yī)治肝常用中草藥，入肝經(jīng)血分，可化瘀、涼肝、解毒、清熱，重樓皂苷Ⅶ是自其提取的一種甾體皂苷化合物，可通過增加線粒體分裂及活性氧產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性誘導(dǎo)卵巢癌凋亡［11-12］。何昊等［13］進(jìn)行了一項(xiàng)關(guān)于重樓皂苷Ⅶ對(duì)胰腺癌細(xì)胞影響的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可抑制胰腺癌PANC-1 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可能通過下調(diào)PD-L1 表達(dá)誘導(dǎo)PANC-1 細(xì)胞凋亡。此外，Zhang等［14］研究認(rèn)為，重樓皂苷Ⅶ可顯著抑制斑馬魚腫瘤異種移植癌細(xì)胞及肝癌荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移，改善轉(zhuǎn)移引發(fā)的肺損傷，降低體外HepG2 細(xì)胞血管生成和轉(zhuǎn)移能力，提示其可作為治療肝癌的潛在候選藥物。

p38 MAPK 信號(hào)通路是一條重要的腫瘤相關(guān)通路，是MAPK 通路家族成員，在惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、自噬等過程中扮演重要角色［15］。p38 MAPK、ERK1/2是該通路重要調(diào)控因子，二者均屬于絲蛋白/蘇氨酸激酶家族，外界交換因子激活通路上游絲/蘇氨酸蛋白激酶引發(fā)MAPK 三級(jí)連接反應(yīng)（MAPKKK-MAPKK-MAPK），p-p38 MAPK 中酪氨酸及蘇氨酸使之激活，進(jìn)一步磷酸化下游唯一底物蛋白ERK1/2，ERK1/2 進(jìn)入細(xì)胞核后調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子活性，參與細(xì)胞能量、死亡抵抗、免疫逃逸、骨架結(jié)構(gòu)改變及細(xì)胞能動(dòng)性調(diào)控，從而發(fā)揮其抑癌功效［16，14］。Han 等［17］體外實(shí)驗(yàn)表明，激活p38 MAPK 通路可抑制人肝細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及G2/M 期阻滯，從而對(duì)肝細(xì)胞癌荷瘤小時(shí)產(chǎn)生治療作用，提示p38 MAPK 通路或可成為肝癌新治療靶點(diǎn)，提升其通路活性可作為肝癌治療未來研究方向之一。Zhang 等［18］在脂多糖刺激的RAW264.7 細(xì)胞和多種動(dòng)物模型中對(duì)重樓皂苷Ⅶ的抗炎活性及其潛在機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅶ在多種體外和體內(nèi)模型中均具有很強(qiáng)的抗炎活性，通過下調(diào)MAPK 和核因子-κB（NF-κB）通路發(fā)揮抗炎作用，可能是其治療癌癥的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅶ組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/2/ERK1/2 升高，在重樓皂苷Ⅶ基礎(chǔ)上增用p38 MAPK 通路抑制劑SB203580 可減弱重樓皂苷Ⅶ對(duì)肝癌的治療作用，提示重樓皂苷Ⅶ可能通過激活該通路治療肝癌。

綜上所述，重樓皂苷Ⅶ可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)行為，并誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與激活p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)。