李雪晗 陸玉建，2，3

（1濱州學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603；3山東省黃河三角洲生態(tài)脆弱帶工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603）

檉柳為檉柳科檉柳屬灌木或小喬木，藥用價值較高[1]。檉柳多分布于東部至西南部地區(qū)，不僅可以生長在嚴寒、干旱和多風(fēng)沙等環(huán)境中，還極耐鹽堿，是典型的鹽生植物[2-3]。檉柳根部有根癌菌，不僅能夠優(yōu)化土壤結(jié)構(gòu)，還可以增加土壤中的有機質(zhì)[4-5]。合理種植檉柳既能有效提升鹽堿地區(qū)的土地利用率，又能擴大荒漠化地區(qū)的綠化覆蓋范圍，對生態(tài)環(huán)境的改善具有重要作用[6-7]。傳統(tǒng)的檉柳繁殖方式是扦插和播種，實踐中檉柳生長速度慢，培養(yǎng)周期長，成苗率低，且易受地理環(huán)境和季節(jié)的限制，難以滿足市場需求[8-10]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)以檉柳作為材料進行離體無性繁殖，觀察和分析不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對檉柳不定芽和生根誘導(dǎo)的影響，篩選檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)的最優(yōu)條件，在此基礎(chǔ)上進一步進行轉(zhuǎn)基因或者誘變，實現(xiàn)生物性狀的改良[11-12]，可促進檉柳快速繁殖。該技術(shù)不僅能夠大幅度縮短培養(yǎng)周期，而且不受時空限制，彌補了檉柳傳統(tǒng)繁殖方式的不足[13-14]。近年來，檉柳的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在快速繁殖、短周期育種等方面取得了較大的進步，在嚴寒、干旱、多風(fēng)沙和重鹽堿等地區(qū)檉柳繁殖發(fā)揮了重要作用。目前檉柳的組織培養(yǎng)技術(shù)仍處于發(fā)展階段，還具有較大的發(fā)展空間。本研究以檉柳嫩莖為材料，分析了不同植物激素對檉柳不定芽誘導(dǎo)以及生根的影響，以建立檉柳高頻離體無性繁殖體系，為檉柳的規(guī)?；N植以及優(yōu)良品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取春季和夏季生長優(yōu)良的檉柳幼嫩莖段為材料。所有試驗材料均取自濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)研究中心植物園。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制根據(jù)前期預(yù)試驗的結(jié)果，設(shè)計9 種檉柳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別為C1，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C2，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C3，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C4，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C5，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C6，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C7，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA；C8，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA；C9，MS+1.50 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA。設(shè)計9種檉柳生根培養(yǎng)基，分別為R1，MS；R2，MS+0.10 mg/L NAA；R3，MS+0.20 mg/L NAA；R4，MS+0.01 mg/L NAA；R5，MS+0.50 mg/L NAA；R6，1/2 MS；R7，1/2 MS+0.10 mg/L NAA；R8，1/2 MS+0.20 mg/L NAA；R9，1/2 MS+0.01 mg/L NAA。

配制方法：稱取適量的MS或1/2 MS固體粉末，加蒸餾水充分攪拌，分別加入3%蔗糖和相應(yīng)的植物生長調(diào)節(jié)劑。定容后調(diào)節(jié)溶液的pH 值至5.8，添加1%瓊脂，分裝，121 ℃高壓滅菌20 min后冷卻備用。

1.2.2 外植體的消毒選取生長優(yōu)良且健康無病害的檉柳枝條作為外植體，將其切成適宜長度的莖段，放入燒杯中。先用流水沖洗30 min，洗衣粉浸泡1 h，再用流水沖洗干凈。隨后轉(zhuǎn)入超凈工作臺中，使用70%乙醇消毒30 s，10%次氯酸鈉處理10 min，消毒期間須輕輕搖晃燒杯，以達到最佳的消毒效果。消毒完成后依次棄去乙醇和次氯酸鈉，使用無菌水反復(fù)沖洗5～6次，將外植體上殘留的乙醇和次氯酸鈉沖洗干凈后即完成整個外植體的消毒。

1.2.3 不定芽的誘導(dǎo)在超凈工作臺中，將消毒后的檉柳外植體切去兩端，去掉發(fā)黃的葉片和枝條。將莖段切為約5 cm 小段，豎直接種到上述9 種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種5～7個外植體，接種完成后灼燒瓶口，蓋上封口膜，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察外植體的生長狀態(tài)，30 d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計算外植體不定芽誘導(dǎo)率，公式如下。

1.2.4 檉柳的生根培養(yǎng)將誘導(dǎo)產(chǎn)生的檉柳不定芽反復(fù)繼代培養(yǎng)，待不定芽生長至5 cm 左右時，選取生長良好的不定芽分別接種到上述9種生根培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的情況，30 d 后統(tǒng)計生根數(shù)并計算生根率，公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽誘導(dǎo)

將檉柳外植體分別接種到C1—C9不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種30 d后，統(tǒng)計和記錄培養(yǎng)基中不定芽生長情況（表1）。試驗結(jié)果表明，在C1培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為86.15%，不定芽生長優(yōu)良且數(shù)量繁多；在C2培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為76.06%，不定芽生長較旺盛；在C3培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為75.66%，雖生長情況較好，但芽量稍少；在C4培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為79.71%，不定芽數(shù)目較多，但部分枝條枯萎；在C5培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為75.70%，叢生芽和單芽混生，枯枝較多；在C6培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率約為80.50%，不定芽數(shù)目較多，但偏黃；在C7培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為50.00%，不定芽生長稀疏，數(shù)量較少，且較為細弱；在C8培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為66.67%，不定芽生長一般，同樣較為細弱；在C9培養(yǎng)基中，檉柳不定芽誘導(dǎo)率為43.30%，不定芽生長稀疏，芽量也較少。在這9 種檉柳不定芽培養(yǎng)基中，C1培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高且誘導(dǎo)出的不定芽生長優(yōu)良，較為健壯。因此，C1培養(yǎng)基可作為檉柳不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，用于后續(xù)檉柳不定芽的大量誘導(dǎo)和擴繁。

表1 檉柳的不定芽誘導(dǎo)情況

續(xù)表1 檉柳的不定芽誘導(dǎo)情況

2.2 生根培養(yǎng)

選取較綠的檉柳嫩芽接種到R1—R9培養(yǎng)基中進行生根誘導(dǎo)，30 d 后觀察和統(tǒng)計生根數(shù)目并計算生根率（表2）。試驗結(jié)果顯示，在R1培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為72.23%，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的根較為細長且數(shù)量較少；在R2培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為54.29%，誘導(dǎo)產(chǎn)生根的數(shù)量極少，長度也較短，部分苗存在干枯現(xiàn)象；在R3培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率約為63.33%，誘導(dǎo)產(chǎn)生根的數(shù)量相對較少，根的長度也較短，且幼苗生長比較緩慢；在R4培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率達到76.10%，培養(yǎng)基中生根情況與R1相似，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根較為細長且數(shù)量不多；在R5培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為69.28%，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的數(shù)量相對較少，根的長度也較短且生長比較緩慢；在R6培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率達到97.22%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根數(shù)量較多，根系較發(fā)達，幼苗生長旺盛；在R7培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為52.91%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量極少，長度極短，且幼苗的生長緩慢；在R8培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率和R7接近，不定根的誘導(dǎo)情況也較相似，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量少，長度短，幼苗的生長情況不佳；在R9培養(yǎng)基中，檉柳不定芽的生根率為95.84%，和R6培養(yǎng)基中不定根的誘導(dǎo)率較接近，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根數(shù)量多，生長迅速，幼苗的生長狀況良好。由上可得，在這9種生根培養(yǎng)基中，R6培養(yǎng)基可作為最適宜的檉柳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用于檉柳不定芽的生根誘導(dǎo)，經(jīng)30 d生根誘導(dǎo)，可獲得大量的試管苗。

表2 檉柳的生根培養(yǎng)情況

2.3 離體再生

采取生長優(yōu)良的檉柳枝條，用清水沖洗掉枝條表面的泥土，轉(zhuǎn)至超凈工作臺中，在無菌條件下用70%乙醇和0.1%次氯酸鈉進行消毒處理，消毒完畢后用無菌水反復(fù)沖洗5～6 次，用鑷子和解剖刀將外植體切至5 cm 左右，接種到最適不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基C1中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，每瓶接種5～7 個外植體，放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃光照培養(yǎng)。在最適培養(yǎng)基中，檉柳的莖段可誘導(dǎo)長出明顯的不定芽，且隨著培養(yǎng)時間的延長，不定芽數(shù)量逐漸增多。待培養(yǎng)約30 d 后，可觀察到誘導(dǎo)產(chǎn)生的嫩芽粗壯且較密集（圖1A）；選取嫩綠且生長良好的不定芽進行繼代培養(yǎng)，不定芽繼續(xù)生長，持續(xù)培養(yǎng)14 d 后，不定芽的數(shù)量明顯增多。將不定芽轉(zhuǎn)接入新培養(yǎng)基繼續(xù)增殖培養(yǎng)，30 d 后可以看到明顯的叢生芽（圖1B）；將叢生芽進行第一次叢生芽繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d 后，叢生芽繼續(xù)增多，長勢較好；接著再選取生長粗壯健康的叢生芽進行第二次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d 后，叢生芽生長旺盛。當(dāng)檉柳的不定芽生長至5 cm 左右時，將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽在無菌條件下接種到生根最適培養(yǎng)基R6中誘導(dǎo)生根，經(jīng)恒溫培養(yǎng)箱25 ℃光照培養(yǎng)約30 d 后，可看到在檉柳不定芽的基部生長出了數(shù)量較多、長度適中的不定根，根系較發(fā)達，幼苗生長旺盛（圖1C）。此后繼續(xù)進行壯苗培養(yǎng)便可得到數(shù)目較多且生長良好的試管苗。

圖1 檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)

3 結(jié)論與討論

本研究選用檉柳莖段為材料，對其進行不定芽誘導(dǎo)和離體再生培養(yǎng)，觀察和統(tǒng)計外植體不定芽和生根誘導(dǎo)情況。研究發(fā)現(xiàn)，在所設(shè)計的9 種檉柳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，C1培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)率最高，不定芽長勢好且數(shù)量多。C1、C2和C3培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)6-BA 的加入量為1.00 mg/L，NAA 的濃度分別為0.01、0.05 和0.10 mg/L；C4、C5和C6培養(yǎng)基中6-BA 濃度為0.50 mg/L；而在C7—C9培養(yǎng)基中則將植物調(diào)節(jié)生長物質(zhì)NAA 更換為IAB。6-BA 和NAA 是檉柳不定芽誘導(dǎo)比較適宜的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這2 種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最適濃度分別為1.00和0.01 mg/L，在此比例下，檉柳不定芽的分化效果較好。在試驗所設(shè)計的9 種檉柳生根培養(yǎng)基中，R1—R5培養(yǎng)基均使用MS 作為基本培養(yǎng)基，其中R1培養(yǎng)基中沒有添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其他培養(yǎng)基均加入了一定量的NAA，濃度分別為0.10、0.20、0.01和0.50 mg/L；R6—R9培養(yǎng)基均使用1/2 MS作為基本培養(yǎng)基，其中R6培養(yǎng)基中沒有添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其他培養(yǎng)基同樣添加了一定量的NAA，濃度分別為0.10、0.20和0.01 mg/L。結(jié)果表明，不定芽在R6和R9生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的效果較好，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根健康粗壯，根系較發(fā)達，幼苗生長旺盛。由此可見，在檉柳不定芽生根過程中，適當(dāng)減少植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的加入量，對于不定芽的生根有明顯促進作用。因此，宜使用1/2 MS作為檉柳不定芽誘導(dǎo)生根的基本培養(yǎng)基，若要加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，最適宜的方案是在1/2 MS的基礎(chǔ)上加入0.01 mg/L NAA。實踐中，NAA 對檉柳不定芽生根的影響不大，很可能是因為內(nèi)源生長素的含量已滿足不定芽的生根需求。本研究通過分析影響檉柳不定芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)的因素，建立了檉柳離體無性繁殖體系，為檉柳的規(guī)?；N植以及優(yōu)良品種的選育提供參考。