于欣茹

（阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽 阜陽 236065）

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）是由土壤傳播的病原菌，可導(dǎo)致棉花黃萎病，常存在于寄主植物的維管束系統(tǒng)中，一般殺菌劑無法接觸到病原體[1]。赤霉病由多種鐮刀菌侵染引起，病原菌主要以菌絲體在寄主病殘?bào)w或種子上越夏過冬，也可在土壤中營腐生生活過冬[2]。棉花與其根際真菌的共生關(guān)系使棉花獲得對(duì)病原體的一定抗性，同時(shí)可改善其發(fā)育過程和提高產(chǎn)量，促進(jìn)養(yǎng)分吸收和提高肥料使用效率。研究表明，木霉（Trichodermasp.）作為低成本、有效和環(huán)保的生物防治劑，可在各種病理系統(tǒng)中建立自己的位置，對(duì)土壤平衡的影響較小，且不會(huì)損害控制病原體的有益生物[3]。黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種植物溶磷真菌，可用作潛在的生物肥料，能增加土壤磷酸鹽對(duì)植物的生物有效性[4]。通過調(diào)整土壤微生物的生態(tài)，將生防菌株制成有機(jī)肥來創(chuàng)造良好的根際微生物環(huán)境，以達(dá)到防控土傳病害的研究在當(dāng)前備受關(guān)注。利用有益微生物防治植物病害是切實(shí)可行的策略之一，尋找環(huán)境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黃萎病及赤霉病等病害防治的發(fā)展方向之一。本試驗(yàn)從中棉所08 等6 個(gè)陸地棉品種的根際土壤中分離出真菌，并篩選出拮抗赤霉病菌和大麗輪枝菌，且對(duì)棉花種子安全性無影響的真菌，為提高生物防治真菌利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、魯棉研28 和魯棉研21植株的根際土壤；病原菌株為赤霉病菌（Fusarium graminearum）F0609、大麗輪枝菌V1070；蘇棉9號(hào)種子。

硫酸卡那霉素（Kanamycin），利福平（Rifampicin），Maker DL2000（TaKaRa公司），PCR相關(guān)試劑購自南京諾唯贊公司。

無菌操作臺(tái)，高壓蒸氣滅菌鍋，電泳儀（EPS601型），PCR儀，光學(xué)顯微鏡（南京江南永新），掃描電鏡（日立S-3000N，日本Hitachi）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同棉花品種根際真菌的分離刮取不同棉花品種根表附著的土壤，用無菌水制成懸浮液（1 g土壤溶于100 mL水中），搖勻靜置取上清液，用梯度稀釋法涂布在有硫酸卡那霉素（50 mg/L）和利福平（50 mg/L）的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（Potato Glucose Agar，PDA）平板上，每個(gè)品種3次重復(fù)。選取合適的濃度（每皿30～300 個(gè)菌落）對(duì)菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)平板上菌落的顏色、形態(tài)和大小等挑取不同單菌落，平板劃線純化后4 ℃保存。

1.2.2 根際真菌對(duì)赤霉病菌的拮抗作用用異步培養(yǎng)法于PDA 平板中心接種直徑5 mm 赤霉病菌F0609 菌餅，28 ℃培養(yǎng)2 d 后，在距菌餅1 cm 處的四周接種分離得到的根際真菌，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，以不接種根際真菌為對(duì)照。當(dāng)對(duì)照赤霉病菌F0609 長至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，測量抑菌率。每菌株重復(fù)3次。

抑菌率（%）=1－處理病原菌的直徑÷對(duì)照病原菌的直徑×100。

1.2.3 根際真菌的鑒定將分離到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)，顯微鏡下觀察菌絲和孢子，參照《真菌鑒定手冊》[5]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

依據(jù)各品種根際真菌優(yōu)勢種群和抑菌率效果，提取抑菌率高的菌株基因組DNA 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增菌株的18S rDNA序列。

PCR反應(yīng)體系：2×High Fidelity Mix12.5 μL引物（20 μmol/L）1.0 μL DNA模板1.0 μL超純水9.5 μL總體積25.0 μL

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物委托第三方公司南京擎科進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.4 根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070的拮抗作用鑒定將已鑒定的10 株真菌分別與大麗輪枝菌V1070 進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，在PDA 平板上間隔3 cm接根際真菌和大麗輪枝菌V1070菌餅（直徑5 mm），28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察記錄抑菌率，選出抑菌率較高的真菌。

1.2.5 根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070 菌絲的影響從對(duì)峙的平板上挑取大麗輪枝菌V1070和拮抗真菌間接近但不接觸的菌絲，用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，以平板上單獨(dú)生長的大麗輪枝菌V1070菌絲做對(duì)照。

1.2.6 根際真菌對(duì)種子發(fā)芽的安全性測驗(yàn)將黑曲霉An1 菌株于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)液中培養(yǎng)（28 ℃，150 rpm）48 h，過濾除去黏連菌絲。用純水將濾液稀釋10倍浸泡蘇棉9號(hào)種子8 h，對(duì)照組用無菌水浸泡。在滅菌的營養(yǎng)土和蛭石為1∶3 的基質(zhì)中播種100粒，以露白5 mm作為發(fā)芽指標(biāo)，3 d后開始計(jì)數(shù)發(fā)芽率和鮮重并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際真菌對(duì)赤霉病菌F0609的拮抗作用

用十字交叉法計(jì)算抑菌率，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)不同棉花品種根際真菌中優(yōu)勢種群相同，對(duì)赤霉病菌F0609 有拮抗效果的大多數(shù)是曲霉屬、青霉屬和木霉屬（圖1）。其中，中棉所08 根際真菌的平均抑菌率為35.31%，中棉所41 為30.28%，中植棉2 號(hào)21.50%，魯棉研28 為26.39%，魯棉研21 為12.06%，冀棉11 為20.33%。即棉花根際土壤中存在對(duì)赤霉病菌F0609 有拮抗效果的土壤真菌，中棉所08和中棉所41中選取的菌株平均抑菌率較高。

圖1 各品種棉花根際真菌拮抗赤霉菌F0609的分離

2.2 根際真菌測序及鑒定

選取拮抗赤霉病菌F0609效果好的10個(gè)根際真菌菌株，標(biāo)號(hào)1—10（圖2），提取18S rDNA送南京擎科公司測序。在BLAST上檢索同源性（表1），10個(gè)拮抗真菌菌株包括5個(gè)屬，其中曲霉屬有5個(gè)，為優(yōu)勢種群，青霉屬1個(gè)，木霉屬1個(gè)，鐮刀霉屬2個(gè)，被孢霉屬1個(gè)。

表1 10株根際真菌的18S rDNA部分序列分析

圖2 菌液18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.3 根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070的拮抗作用

將已鑒定的10 株真菌分別與大麗輪枝菌V1070 進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出抑菌率較高的菌株4 株，分別為來自中棉所08 的黑曲霉An1、來自魯棉研21 的棘孢木霉Tr1、來自魯棉研21 的層出鐮孢霉Fu1 和來自冀棉11 的高山被孢霉Mo1，分別與大麗輪枝菌V1070 在PDA 培養(yǎng)基上對(duì)峙培養(yǎng)，觀察到4種根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070有不同程度的拮抗效應(yīng)（圖3），其中，黑曲霉菌An1 和棘孢木霉Tr1對(duì)大麗輪枝菌V1070的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，An1對(duì)大麗輪枝菌V1070 的平均抑菌率達(dá)91%，Tr1 為87%，高山被孢霉Mo1 為76%，層出鐮孢霉Fu1 抑制率為70%。這4 種真菌均有作為生物防治真菌應(yīng)用的潛力。

圖3 4種棉花根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070的拮抗作用

2.4 根際真菌對(duì)大麗輪枝菌V1070菌絲的影響

用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察平板上接近而不接觸的菌絲。用光學(xué)顯微鏡可看到黑曲霉An1對(duì)大麗輪枝菌V1070造成不同程度的損傷，表現(xiàn)為菌絲變細(xì)長，褶皺變多，菌絲有孔洞和斷裂，促進(jìn)產(chǎn)孢，分生孢子變多（圖4A）。用掃描電鏡可以看到菌絲分支增多，各部位都有膨大跡象，內(nèi)含物質(zhì)露出，細(xì)胞質(zhì)外泄變得透明卷曲，菌絲體呈念珠狀且頂端細(xì)胞變形膨大，形成球狀空泡（圖4C）。說明黑曲霉An1在平板上通過影響大麗輪枝菌V1070的發(fā)育進(jìn)程，從而產(chǎn)生競爭性抑制。

圖4 An1與V1070對(duì)峙培養(yǎng)12 h后對(duì)菌絲和孢子形態(tài)的影響

2.5 黑曲霉An1對(duì)棉花種子發(fā)芽的影響

經(jīng)黑曲霉An1處理的蘇棉9號(hào)棉花種子5 d 后發(fā)芽率為55%，10 d后鮮重2.9 g/株，對(duì)照組5 d后發(fā)芽率54.6%，10 d 后鮮重2.3 g/株（圖5），表明黑曲霉An1 處理對(duì)蘇棉9號(hào)種子發(fā)芽及幼苗鮮重積累的影響均不明顯。

圖5 黑曲霉An1對(duì)種子發(fā)芽的影響

3 結(jié)論與討論

相關(guān)研究表明，許多絲狀真菌，例如里氏木霉（Trichoderma reesei），能分泌多種纖維素分解酶，可以抑制病源真菌的生長，破壞細(xì)胞新物質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致菌絲體從頂端破碎，內(nèi)容物外泄，直至死亡[6]。從多種植物根際土壤可分離到對(duì)根癌農(nóng)桿菌有明顯抑制效果的黑曲霉[7]。新陸中37棉花根際土壤中篩選的4 株粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）、3 株高山被孢霉（Mortierella alpina）以及1 株球毛殼菌（Chaetomium globosum）對(duì)大麗輪枝菌均有一定的拮抗作用[8]。來源于土壤的菌株赭曲霉（Aspergillus ochraceus）AAM-1 對(duì)大腸埃希氏菌和白菜黑腐病菌顯示較好的抑菌效果[9]。木霉和青霉混合施用使小麥紋枯病和赤霉病發(fā)病率明顯降低[10]。黑曲霉孢子的代謝產(chǎn)物對(duì)青枯雷爾氏菌和軟腐歐文氏菌有顯著的拮抗活性[11]。健康棉株的內(nèi)生真菌鐮孢鐮刀菌CEF559 對(duì)黃萎病有生物防治潛力，CEF559 可完全抑制大麗輪枝菌分生孢子的產(chǎn)生，溫室研究中，CEF559 對(duì)青枯病的防治效果大于60%[12]。從鳳凰木的根際土壤中分離的曲霉屬真菌得到化合物，對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和近平滑念珠菌有抗菌活性[13]。大量具有生防潛力的根際微生物棲息在根表，能更好地定殖在植株根系，且安全無污染，同時(shí)可以避免類似化學(xué)藥劑施用后病原菌產(chǎn)生的抗性問題[14]。

由于拮抗赤霉菌的真菌報(bào)道較少，因此先篩選抗赤霉菌的根際真菌，再篩選抗大麗輪枝菌的根際真菌。本研究從6個(gè)陸地棉品種（中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、魯棉研28 和魯棉研21）的根際土壤中，分離出64 株對(duì)赤霉病菌F0609 具有抑制作用的真菌，選取10 株進(jìn)行測序鑒定，其中黑曲霉An1、棘孢木霉Tr1、層出鐮孢霉Fu1 和高山被孢霉Mo1，對(duì)大麗輪枝菌V1070 的抑制率分別為91%、87%、76%和70%。用掃描電鏡觀察拮抗真菌黑曲霉An1 對(duì)大麗輪枝菌V1070 菌絲的影響，發(fā)現(xiàn)黑曲霉An1使大麗輪枝菌V1070形態(tài)異常，孢子破裂，生長受到抑制。用黑曲霉An1 處理棉花的種子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)棉花種子發(fā)芽率和鮮重?zé)o明顯影響。下一步研究將圍繞幾種真菌的拮抗機(jī)制及具體生防應(yīng)用展開，為提高生防菌的利用效率提供參考。