接琳琳，于 寧，孫秀玲，張彩霞，張 淼

（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 264199；2.煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 煙臺(tái) 264001）

坐骨神經(jīng)損傷是一種臨床常見(jiàn)病，預(yù)后差、恢復(fù)慢、病后伴長(zhǎng)期神經(jīng)性疼痛，甚至?xí)斐捎谰眯赃\(yùn)動(dòng)能力損傷，給患者造成心理障礙，也給社會(huì)帶來(lái)重大負(fù)擔(dān)[1]。臨床對(duì)于坐骨神經(jīng)損傷的治療方法眾多，如西醫(yī)療法[2]、中醫(yī)中藥[3]、干細(xì)胞[4]等。髓鞘結(jié)構(gòu)異?？蓪?dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)病理性疼痛[5]等。雪旺細(xì)胞是構(gòu)成周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)髓鞘的膠質(zhì)細(xì)胞，其形成的髓鞘包膜可促進(jìn)軸突存活和生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)[6]。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過(guò)調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2來(lái)增強(qiáng)雪旺細(xì)胞的增殖和髓鞘化，進(jìn)而修復(fù)損傷的坐骨神經(jīng)。

腎著湯記載自《金匱要略》中，又稱甘草干姜茯苓白術(shù)湯，其組成為甘草、白術(shù)、干姜和茯苓，功效為祛寒除濕，主治腎著病。趙天才等[8]認(rèn)為該病是因素體虛弱、正氣不足、滕理不密、衛(wèi)外不固、寒濕之邪乘虛而入，注于經(jīng)絡(luò)、留于關(guān)節(jié)，使陽(yáng)氣痹阻于腰部而發(fā)病。名方選解中有關(guān)于腎著湯可用于治療坐骨神經(jīng)痛的報(bào)道[9]。甘草、白術(shù)、干姜、茯苓等四味中藥辛溫甘淡，方中以干姜為君，取其辛熱之性，溫中祛寒；以茯苓為臣，淡滲利濕。兩者配伍，一熱一利，熱以勝寒，利以滲濕，寒去濕消，則病本得除。佐以白術(shù)健脾燥濕，以助除濕；使以甘草調(diào)諸藥而和脾胃。四藥配合，共奏祛寒除濕之效，寒濕盡去，則冷重自愈。

研究檢測(cè)應(yīng)用腎著湯后髓鞘的損傷和再生的表達(dá)變化，以期從神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的角度分析腎著湯對(duì)坐骨神經(jīng)損傷的作用，為闡明腎著湯在坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘再生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床治療坐骨神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和造模腎著湯制備：方劑組成為甘草 6 g、白術(shù) 6 g、干姜 12 g、茯苓 12 g，加入1 000 mL水煎至600 mL，分裝至于4 ℃冰箱備用。對(duì)實(shí)驗(yàn)7 d組小鼠灌胃3次/d，早中晚各1次。

造模：24只成年雄性昆明小鼠，研究過(guò)程遵循國(guó)際通行的動(dòng)物福利和倫理準(zhǔn)則。以隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、對(duì)照7 d組（損傷）、實(shí)驗(yàn)7 d組（損傷后予以腎著湯灌胃）。正常組不做任何處理，其余2組使用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后暴露坐骨神經(jīng)，使用血管鉗交替夾住和松開(kāi)1 cm長(zhǎng)坐骨神經(jīng)3次，夾住10 s后松開(kāi)30 s，再制作坐骨神經(jīng)損傷模型。對(duì)照7 d組制作坐骨神經(jīng)損傷模型后，每天正常飼養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)7 d組在對(duì)照7 d組基礎(chǔ)上，早中晚各予以灌胃腎著湯。

電鏡觀察：取材后，一部分坐骨神經(jīng)使用1%四氧化鋨酸固定，用于電鏡觀察。取小鼠坐骨神經(jīng)修剪成 1 mm3立方體，在4 ℃的2.5%戊二醛溶液內(nèi)固定過(guò)夜。第2天使用1%四氧化鋨酸固定3 h后，依次浸入乙醇、丙酮中，包埋、切片，最后采用鈾染色，并于透射電子顯微鏡下觀察。

染色觀察：一部分坐骨神經(jīng)用4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行包埋后切片。伊紅染色法（HE染色）：將切片脫蠟處理后放入蘇木精水溶液中染色3 min，氨水中分色10 s。流水沖洗后放入酒精中梯度脫水，酒精伊紅染色液染色2～3 min，再經(jīng)二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片。勞克堅(jiān)牢藍(lán)(luxol fast blue)染色：將切片脫蠟處理后，放入Luxol Fast Blue染色液室溫過(guò)夜，將切片放入95%乙醇洗掉多余染色液后蒸餾水沖洗。分色液分色15 s后，70%乙醇分色30 s 至灰白質(zhì)清晰，蒸餾水沖洗，再入伊紅染色液體，后脫水、透明，封片。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變HE染色中可見(jiàn)正常組坐骨神經(jīng)髓鞘排列規(guī)則緊密，見(jiàn)圖1-a；在對(duì)照7 d組的坐骨神經(jīng)中髓鞘出現(xiàn)形態(tài)變化，雜亂無(wú)章，部分區(qū)域出現(xiàn)脫髓鞘現(xiàn)象，見(jiàn)圖1-b；實(shí)驗(yàn)7 d組髓鞘結(jié)構(gòu)開(kāi)始修復(fù)，髓鞘結(jié)構(gòu)排列較緊密，見(jiàn)圖1-c。

圖1 HE染色中各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

2.2 電鏡觀察坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變電子顯微鏡圖像顯示正常組坐骨神經(jīng)髓鞘呈同心圓層狀排列，結(jié)構(gòu)致密且清晰，見(jiàn)圖2-a；在對(duì)照7 d組的坐骨神經(jīng)中髓鞘出現(xiàn)形態(tài)變化，同心圓層狀出現(xiàn)折疊、雜亂無(wú)章，部分區(qū)域出現(xiàn)空泡、脫髓鞘的現(xiàn)象，見(jiàn)圖2-b；實(shí)驗(yàn)7 d組髓鞘結(jié)構(gòu)開(kāi)始修復(fù)，髓鞘松解情況改善，見(jiàn)圖2-c。

圖2 電鏡下各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

2.3 勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色觀察坐骨神經(jīng)損傷髓鞘的改變勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果顯示，正常組髓鞘呈藍(lán)色，結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)髓鞘脫失，見(jiàn)圖3-a；對(duì)照7 d組中可見(jiàn)藍(lán)色區(qū)域極少，可見(jiàn)廣泛性脫髓鞘區(qū)域，見(jiàn)圖3-b；實(shí)驗(yàn)7 d組切片中藍(lán)色區(qū)域明顯增多，髓鞘結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，藍(lán)染髓鞘增多，見(jiàn)圖3-c。

圖3 勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色中各組坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘的形態(tài)學(xué)改變（×400）

3 討論

坐骨神經(jīng)損傷是臨床上一種常見(jiàn)疾病，損傷中可見(jiàn)結(jié)締組織、髓鞘和軸突等多種損傷，通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙甚至永久性殘障。雪旺細(xì)胞的高度可塑性是創(chuàng)傷性損傷和周?chē)窠?jīng)病變后再生的關(guān)鍵因素。較嚴(yán)重的周?chē)窠?jīng)損傷，如撕脫傷、撕裂傷和挫傷，因介導(dǎo)再生所需的雪旺細(xì)胞損傷或死亡而受到影響，甚至由于雪旺細(xì)胞再生速度緩慢，遠(yuǎn)端神經(jīng)再生可能需要數(shù)月或數(shù)年，甚至可能最終喪失再生能力[10-11]。盡管現(xiàn)代診斷和顯微外科技術(shù)進(jìn)步，但坐骨神經(jīng)修復(fù)后的功能恢復(fù)往往不夠理想。

現(xiàn)代臨床對(duì)于坐骨神經(jīng)損傷治療手段眾多，其中髓鞘的清除和再生是促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的有效方式。研究發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)損傷模型中，7，8-二羥基香豆素可促進(jìn)髓鞘的再生和損傷神經(jīng)的恢復(fù)[12]。香菇多糖主要通過(guò)加速雪旺細(xì)胞中髓鞘碎片的自噬清除來(lái)促進(jìn)神經(jīng)再生，這個(gè)過(guò)程可能受到AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控[13]。姜黃素可通過(guò)調(diào)控RUNX家族轉(zhuǎn)錄因子2來(lái)增強(qiáng)雪旺細(xì)胞的增殖和髓鞘化，進(jìn)而促進(jìn)損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)[7]。

腎著湯在臨床已得到廣泛應(yīng)用，但目前尚無(wú)對(duì)于腎著湯治療坐骨神經(jīng)損傷具體機(jī)制的研究。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用腎著湯7 d后，髓鞘開(kāi)始增生，而未用藥組髓鞘修復(fù)時(shí)間則大大延長(zhǎng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，干姜的主要化學(xué)成分是以α-姜烯為主的多種揮發(fā)油，有抗炎、殺菌等作用[14]，此外在治療腰椎間盤(pán)突出癥中發(fā)現(xiàn)干姜中的姜黃素既可介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，又可激活更多的活性氧和細(xì)胞凋亡[15]。茯苓中的三萜類(lèi)和多糖類(lèi)物質(zhì)也有很好的抗炎、增強(qiáng)免疫功能的作用[16]。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯類(lèi)在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面具有明顯作用，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可抑制線粒體裂變緩解神經(jīng)炎癥[17]。甘草中的黃酮類(lèi)化合物具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)、提高免疫力等多種作用。腎著湯具有重要的神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎作用，已通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在治療腰椎間盤(pán)突出治療中得到證實(shí)[18]。

多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病均伴隨髓鞘結(jié)構(gòu)異常，如阿爾茨海默病、佩-梅病和神經(jīng)病理性疼痛[5]。周?chē)窠?jīng)如視神經(jīng)、動(dòng)眼神經(jīng)、坐骨神經(jīng)損傷與修復(fù)中，均可見(jiàn)髓鞘結(jié)構(gòu)的改變[19]。

本研究采用小鼠坐骨神經(jīng)損傷作為周?chē)窠?jīng)損傷的模型，在HE和電鏡下均明顯觀察到對(duì)照7 d組坐骨神經(jīng)髓鞘出現(xiàn)折疊、雜亂無(wú)章甚至脫髓鞘的表現(xiàn)。腎著湯灌胃7 d后髓鞘開(kāi)始改善，勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色同樣可見(jiàn)腎著湯灌胃后藍(lán)染區(qū)域增多，與對(duì)照7 d組比較，髓鞘再生明顯。研究發(fā)現(xiàn)，修復(fù)型雪旺細(xì)胞可通過(guò)作用于c-Jun蛋白、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、音猬因子（SHH）的遺傳因子、染色質(zhì)的修飾控制、調(diào)節(jié)修復(fù)程序，促進(jìn)神經(jīng)元存活、受損軸突崩解、髓鞘清除、軸突再生并引導(dǎo)至其前靶標(biāo)，最終促進(jìn)軸突的再生[20-21]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明腎著湯有重要的神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎的作用[18]，且腎著湯為《金匱要略》[22-25]中用于治療寒濕滯著下焦所致腎著病的經(jīng)典名方,其用藥組方充分體現(xiàn)了張仲景治病求本、重視脾胃、因證制宜、祛邪安正等治療思想，而張仲景對(duì)于腎著病因病機(jī)的剖析以及在詳審腎著病機(jī)病位后所采用的理中焦、顧下焦的靈活治法，對(duì)后世中醫(yī)臨床治療雜病極具指導(dǎo)意義，值得后輩醫(yī)者在實(shí)際運(yùn)用中學(xué)習(xí)借鑒。

綜上所述，腎著湯對(duì)坐骨神經(jīng)損傷后髓鞘再生有促進(jìn)作用，腎著湯的作用機(jī)制是今后的研究方向。