王雅欣，劉汶，吳穎，宋思琦，劉穎初，宋瑾，3，張會(huì)存，3

1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 3. 北京市中醫(yī)藥研究所，北京 100010

肝硬化是病毒、飲酒、自身免疫疾病和化學(xué)毒物刺激等因素對(duì)肝臟長(zhǎng)期影響而引起的一種進(jìn)行性慢性肝病。肝硬化發(fā)展過(guò)程中患者常會(huì)出現(xiàn)腹水、感染、肝性腦病、肝腎綜合征和癌癥等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者健康[1-2]。中西醫(yī)結(jié)合治療被認(rèn)為是控制肝硬化發(fā)生發(fā)展的有效途徑之一，明確肝硬化發(fā)生機(jī)制，針對(duì)相關(guān)的基因靶點(diǎn)挖掘潛在的治療中藥，對(duì)肝硬化的臨床診斷及治療具有重大意義[3]。

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的脂質(zhì)過(guò)氧化所致的新型的程序性細(xì)胞死亡形式。大量研究表明，鐵死亡與慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，多種中藥成分被證明可以通過(guò)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞鐵死亡抑制肝纖維化來(lái)達(dá)到治療肝硬化的目的[4-7]。本研究利用生物信息技術(shù)篩選肝硬化鐵死亡相關(guān)差異基因，并預(yù)測(cè)具有潛在治療作用的中藥及有效成分，為臨床通過(guò)誘導(dǎo)鐵死亡途徑治療肝硬化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）（http：//www.ncbi.nim.nih. gov/geo/）獲取肝硬化相關(guān)基因數(shù)據(jù)集，將樣本量大于20，同時(shí)包含正常樣本和疾病樣本作為篩選條件[8]。選取的數(shù)據(jù)集編號(hào)為GSE77627，該數(shù)據(jù)集包含36 例樣本，其中22 例為肝硬化患者樣本，14 例為對(duì)照組樣本[9]。以|log2FC|≥1，校正后P值＜0.05 作為篩選條件，使用R 軟件對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異化分析，獲取肝硬化差異表達(dá)基因集（DEGs），并通過(guò)R 語(yǔ)言繪制熱圖及火山圖[10]。利用FerrDb 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.zhounan.org/ferrdb/current/）收集鐵死亡相關(guān)基因（FRGs），取DEGs 和FRGs 交集，得到與鐵死亡相關(guān)的肝硬化差異表達(dá)基因。

1.2 蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析將肝硬化中鐵死亡相關(guān)的差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn. string-db. org/）進(jìn)行 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析， 采用Cytoscape3.8.0 軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化； 利用cytohubba 插件中的最大集團(tuán)中心性（MCC）算法進(jìn)行核心基因篩選，得分排前5 的基因作為核心基因[11]。

1.3 富集分析利用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org/）進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析，其中GO 富集分析包括分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）、生物過(guò)程（BP）分析，通過(guò)在線工具將富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。為了進(jìn)一步了解核心基因與鐵死亡的相關(guān)性，將基因芯片樣本按核心基因表達(dá)量中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，以“WP_FERROPTOSIS 基因集”作為背景，通過(guò)GSEA4.3.2 軟件采用默認(rèn)加權(quán)富集法，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)1 000 次，以校正P值＜0.05，|NES |＞1 作為閾值條件對(duì)核心基因進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）[12]。

1.4 中藥及成分預(yù)測(cè)利用Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//coremine.com/medical/#search）搜集核心基因?qū)?yīng)的中藥，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//tcmspw. com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行有效活性成分篩選[13]。借助Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建核心中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 值由高到低進(jìn)行排序，篩選出degree 值排名前4 位的活性成分作為核心活性成分。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲得核心活性成分3D 結(jié)構(gòu)文件，通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org）獲得核心基因的3D 結(jié)構(gòu)文件，采用Autodock Vina 軟件將核心活性成分和核心基因進(jìn)行分子對(duì)接。利用Pymol 軟件將分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 肝硬化鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)分析結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。利用R 軟件對(duì)GSE77627 基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，共獲得3 675 個(gè)DEGs，包括2 301 個(gè)上調(diào)基因和1 374 個(gè)下調(diào)基因，將結(jié)果繪制為火山圖，對(duì)上下調(diào)最大的5 個(gè)基因進(jìn)行標(biāo)注，將差異表達(dá)最大的20 個(gè)基因繪制基因熱圖。在FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得483 個(gè)FRGs。將DEGs 和FRGs 基因取交集，共得到67 個(gè)與肝硬化鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因。

圖1 肝硬化鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因分析圖

圖2 肝硬化差異表達(dá)基因和鐵死亡相關(guān)基因韋恩圖

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因獲取結(jié)果見(jiàn)圖3。將67 個(gè)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 軟件進(jìn)行可視化，顏色越深代表與該基因靶點(diǎn)相互作用的靶點(diǎn)數(shù)量越多。通過(guò)cytohubba 插件中MCC 算法確定核心基因，排名前5的核心基因分別為沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、過(guò)氧化物酶體增殖活化受體α（PPARα）和核因子紅細(xì)胞2 相關(guān)因子2（NFE2L2）。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析圖與核心基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 富集分析結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。對(duì)67 個(gè)基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，將KEGG 通路富集分析結(jié)果繪制為氣泡圖，將GO 分析中的MF、BP、CC 結(jié)果繪制為條形圖。結(jié)果顯示，主要KEGG 通路包括p53 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、FoxO 信號(hào)通路等。GO 分析富集的MF 包括RNA 結(jié)合、蛋白磷酸結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等；BP 包括單體代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)、含磷化合物代謝過(guò)程等；CC 包括胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞器內(nèi)腔、膜封閉腔等。

圖4 GO 及KEGG 通路富集分析圖

圖5 GSEA 富集分析結(jié)果圖

為了進(jìn)一步了解核心基因在肝硬化患者中表達(dá)，且與鐵死亡的相關(guān)性，用GSEA4.3.2 軟件進(jìn)行GSEA富集分析。富集結(jié)果顯示，核心基因NES＞1.78，P＜0.01，提示核心基因在鐵死亡通路中高度富集，進(jìn)一步驗(yàn)證了核心基因與鐵死亡通路密切相關(guān)。

2.4 潛在中藥及成分預(yù)測(cè)見(jiàn)表1、圖6。將核心基因?qū)隒oremine Medical 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到核心基因?qū)?yīng)的中藥。將上述中藥取交集，得到核心基因的共有中藥17 味，包括丹參、枸杞子、黃芩、赤芍、銀杏葉、人參、紅花、白果、大黃、黃連、人參葉、烏梅、石榴皮、生姜、干姜、姜黃、厚樸，其中degree值排名前4 位的分別是丹參、枸杞子、黃芩、赤芍。通過(guò)TCMSP 收集得到271 個(gè)活性成分，利用Cytoscape3.8.0 軟件構(gòu)建核心中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)圖，將degree 值排名前4 位的活性成分確定為核心活性成分，分別為β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚。

表1 核心活性成分

圖6 核心中藥-活性成分網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果一般認(rèn)為化合物和靶點(diǎn)結(jié)合能＜0，提示兩者可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，配體和受體結(jié)合越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大[14]。見(jiàn)表2、圖7。利用Autodock Vina 將4 個(gè)核心活性成分與5 個(gè)核心基因進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMol 軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)合能排前4 位分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。結(jié)果顯示，β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚與SIRT1、EGFR、IL-6、PPARα、NFE2L2 的結(jié)合能均＜0。

表2 核心活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果 kcal/mol

圖7 核心成分與核心基因靶點(diǎn)分子對(duì)接示意圖

3 討論

肝硬化是以廣泛性肝細(xì)胞變性壞死、結(jié)節(jié)性再生、肝臟彌漫性纖維化伴肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和假小葉形成為特征的慢性肝臟疾病[15]。本研究通過(guò)生物信息技術(shù)篩選得到5 個(gè)核心基因分別為SIRT1、EGFR、IL-6、PPARα 和NFE2L2。SIRT1 是一種組蛋白去乙?；?，參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，在肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。SIRT1 介導(dǎo)的SIRT1/核因子E2 相關(guān)因子2（NRF2）/血紅素加氧酶1（HO-1）途徑是調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵途徑之一，研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)SIRT1/NRF2/HO-1 途徑能夠抑制鐵死亡，減輕藥物誘導(dǎo)的急性肝損傷[16]。SIRT1 可以通過(guò)誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞鐵死亡阻斷肝星狀細(xì)胞活化[17]。EGFR 是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，為重要的信號(hào)通路受體，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是肝再生過(guò)程中最主要的信號(hào)通路之一，和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)促進(jìn)泛素化介導(dǎo)的EGFR 降解和加速細(xì)胞內(nèi)內(nèi)涵體運(yùn)輸能抑制EGFR 活化，可以增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞鐵死亡[18]。IL-6 是由多種細(xì)胞合成的促炎細(xì)胞因子，臨床上發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清中IL-6 水平異常升高；實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制IL-6 等促炎細(xì)胞因子的釋放，可以抑制鐵死亡誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[19]。PPARα 是一種過(guò)氧化物酶體增殖活化受體，研究發(fā)現(xiàn)PPARα 可以通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）及轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）來(lái)減輕肝臟中的鐵死亡[20]。同時(shí)本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)調(diào)肝祛脂方可以提高SIRT1/PPARα 表達(dá)來(lái)改善非酒精性脂肪肝大鼠肝功能，減輕非酒精性脂肪肝肝臟細(xì)胞變性[21]。NFE2L2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，是響應(yīng)氧化損傷的內(nèi)源性細(xì)胞防御機(jī)制中的重要因子，參與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)過(guò)程。NFE2L2 在研究中被發(fā)現(xiàn)可以抑制鐵死亡，在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡中起到重要作用[22]。上述結(jié)果表明，核心基因SIRT1、EGFR、IL-6、PPARα 和NFE2L2 可能是治療肝硬化的潛在靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)上述基因參與的信號(hào)通路包括p53 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、FoxO 信號(hào)通路等。FoxO 信號(hào)通路與SIRT1 通路密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)FoxO 信號(hào)通路可以通過(guò)自噬、細(xì)胞凋亡和脫鐵途徑以減少氧化應(yīng)激損傷[23-24]。谷胱甘肽代謝是鐵死亡的關(guān)鍵途徑，谷胱甘肽耗竭，脂質(zhì)氧化物不能經(jīng)GPX4 催化的還原反應(yīng)代謝，繼而二價(jià)鐵離子氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量活性氧簇，促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[25]。P53 可以調(diào)控胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制GSH 合成，從而誘導(dǎo)鐵死亡[26]。GSEA 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核心基因在鐵死亡通路中高度富集。上述研究結(jié)果表明p53 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、FoxO 信號(hào)通路等可能調(diào)控鐵死亡途徑治療肝硬化。

通過(guò)Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)得到17 種中藥，其中排名前4 的中藥為丹參、枸杞子、黃芩和赤芍。劉汶教授認(rèn)為肝硬化本質(zhì)為氣機(jī)升降失常、氣血運(yùn)行不暢，常用丹參、枸杞子等藥物組成養(yǎng)血活血方治療，常取得良好療效[27]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用恩替卡韋、丹參聯(lián)合螺內(nèi)酯治療乙肝后肝硬化腹水可以提升整體治療療效[28]。仝小林院士認(rèn)為肝硬化早期病機(jī)以瘀阻血絡(luò)為主，治療應(yīng)以活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)為總則，臨床應(yīng)用丹參、赤芍、醋鱉甲組成的三味小方，在此基礎(chǔ)上加減化裁治療肝硬化，可取得良好的療效[29]。既往研究發(fā)現(xiàn)，枸杞子通過(guò)抗氧化還原反應(yīng)，對(duì)于肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[30]。黃芩-赤芍能通過(guò)抑制Toll 樣受體4/髓樣分化因子88/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（TLR4/MyD88/NF-κB）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳類(lèi)動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號(hào)通路的表達(dá)來(lái)抑制肝纖維化的發(fā)展，從而緩解藥物引起的肝損傷[31]。本研究得到β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚核心活性成分可能是通過(guò)調(diào)控鐵死亡治療肝硬化的有效活性成分。β-谷甾醇存在于黃芩、枸杞子及赤芍等藥物中，研究發(fā)現(xiàn)其可以減輕四氯化碳誘導(dǎo)大鼠的氧化應(yīng)激和慢性肝損傷[32]；研究發(fā)現(xiàn)黃芩可以調(diào)控鐵死亡逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥，而其中的β-谷甾醇可能是主要有效成分之一[32]。豆甾醇存在于黃芩、枸杞子及赤芍等藥物中，目前研究豆甾醇調(diào)控鐵死亡治療肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究較少。生物信息研究顯示，豆甾醇可以通過(guò)調(diào)控鐵死亡治療非酒精性脂肪性肝炎，含有豆甾醇的中藥具有抑制肝纖維化的作用[33]。槲皮素是一種重要的黃酮類(lèi)化合物，廣泛存在于多種植物中，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞活化來(lái)減少肝纖維化[34]。已有研究證明槲皮素可以通過(guò)減少活性氧、脂質(zhì)過(guò)氧化物和鐵過(guò)載來(lái)抑制鐵死亡，從而控制非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展[35]。山柰酚屬于黃酮類(lèi)化合物的一種，研究顯示山奈酚與鐵死亡關(guān)系密切，山柰酚可以通過(guò)NRF2 通路激活抑制肝細(xì)胞鐵死亡，能夠預(yù)防對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷[36]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，核心活性成分與靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述分析結(jié)果。本研究雖然利用生物信息及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)潛在具有治療作用的中藥及成分進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，但是由于生物信息分析的局限性，未來(lái)需要構(gòu)建實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，丹參、枸杞子、黃芩和赤芍等中藥所含的成分可以通過(guò)SIRT1、EGFR、IL6、PPARα和NFE2L2 等靶點(diǎn)治療肝硬化，其作用機(jī)制可能與p53 信號(hào)通路、谷胱甘肽代謝、FoxO 等信號(hào)通路調(diào)控鐵死亡有關(guān)。