鄔 汶，楊 雨，張 青，鄧曉東，高國龍，劉 楊（通信作者），胡政澤

（1.成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610500；2.四川國際旅行衛(wèi)生保健中心（成都海關口岸門診部），四川 成都 610041；3.口岸疫病疫情監(jiān)測四川省重點實驗室，四川 成都 610041；4.天津國際旅行衛(wèi)生保健中心（天津海關口岸門診部），天津 300450）

隨著我國航空運輸業(yè)的快速發(fā)展，航空食品生產規(guī)模迅速擴大，其背后隱藏的食品安全風險也日益凸顯。過去對航空食品的監(jiān)管監(jiān)測主要針對終端產品進行抽樣檢測，對航空食品生產環(huán)境中的微生物狀況缺少關注和分析。近年來研究發(fā)現，航空食品生產環(huán)境中的微生物是影響航食衛(wèi)生安全的重要因素［1］。因此了解航空食品生產環(huán)境中微生物的種類和分布，對有效控制生產環(huán)境衛(wèi)生、降低微生物污染風險具有重要意義。

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌是一類革蘭氏陰性桿菌，具有廣泛的宿主和分布范圍。腸桿菌科包含31 個菌屬，120 多個菌種［2］，其中少數為致病菌，如沙門菌屬（Salmonella）、志賀菌屬（Shigella）、埃希氏菌屬（Escherichia）的某些血清型、鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）等。腸桿菌科中大多數細菌為人體正常菌群，其中包括一些條件致病菌，當宿主免疫力下降，或者宿主與細菌之間的平衡關系被破壞，條件致病菌就可能成為致病菌。常見的條件致病菌包括克雷伯菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、變形桿菌屬（Proteus）中的細菌。條件致病菌的致病力雖然不及致病菌，但往往會對免疫力低下的特殊人群造成健康威脅，如院內感染中常出現的肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌等［3］。因此，將腸桿菌科用作食品衛(wèi)生指標菌，與大腸菌群等指標菌相比，具有更高的敏感性和準確性，具有更重要的公共衛(wèi)生學意義［4］。

細菌的分子分型，是研究不同菌株之間流行病學關系的重要手段，對分析疾病的傳播途徑具有重要意義。多位點序列分型技術（multi locus sequence typing，MLST）與傳統的分子分型技術（如PFGE、RFLP、RAPD）相比，不需要特殊設備，分辨率更高［5］。隨著測序技術的日益成熟和便捷，MLST 相關數據庫日益完善，該技術已得到廣泛應用［6-8］。

因此本研究采用海綿涂抹法采集航空食品生產車間的操作臺、推車、以及地面的環(huán)境樣本，從中分離鑒定腸桿菌科細菌。再采用MLST 方法對腸桿菌科細菌進行分型分析，通過分析菌株之間的遺傳進化關系，了解航食生產環(huán)境中腸桿菌科細菌的污染狀況和來源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

在成都雙流機場兩家航空食品企業(yè)生產車間的操作臺、推車和地面進行環(huán)境涂抹采樣，共采集樣品32 份。

1.1.2 試劑與儀器

海綿涂抹棒（3M）；腸桿菌科測試片（3M PetrifilmTM）；腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（生物梅里埃ID 32E）；PCR Mix（北京擎科生物科技有限公司）；細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

自動細菌鑒定儀及藥敏分析儀（生物梅里埃ATB）；數碼生物顯微鏡（奧林巴斯CX31）；梯度PCR儀（Eppendorf）；凝膠成像系統（BIO-RAD）；蛋白質核酸電泳系統（BIO-RAD）；測序由北京擎科生物科技有限公司成都分公司完成。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

用3M 海綿涂抹棒，分別在不同車間的操作臺、推車和地面設置的采樣點進行來回涂抹，涂抹面積約為50 cm×50 cm。涂抹后將海綿棒裝入無菌袋并做好標識，低溫下送往實驗室。

1.2.2 分離培養(yǎng)

反復用力擠壓海綿20 次左右，吸取1 mL 采樣液于9 mL 無菌生理鹽水管中形成1∶10 的稀釋液。分別吸取1 mL 采樣原液和1 mL 稀釋液接種于3M腸桿菌科測試片上。放入培養(yǎng)箱中36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h±2 h。挑選典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 生化鑒定

按照腸桿菌科細菌鑒定試劑盒（生物梅里埃ID 32E）說明書，對1.2.2 中分離純化的菌落進行鑒定。

1.2.4 16S rDNA 測序和序列比對

將1.2.2 中分離純化的菌落增菌后，按照試劑盒說明書提取DNA。按文獻［9］方法PCR 擴增細菌16S rDNA 序列，擴增產物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行測序。在美國國家生物技術信息中心（NCBI）的GenBank 數據庫中進行BLAST比對，將相似度最高的比對結果與生化鑒定結果相比較，確定細菌種類。

1.2.5 多位點序列（MLST）分型

選擇數量最多的產酸克雷伯菌的基因組DNA，PCR 擴 增 其7 個 管 家 基 因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB。管家基因的引物序列［10］見表1。

表1 產酸克雷伯菌MLST 分型PCR 引物序列

PCR 擴增產物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行測序。將FASTA 格式的測序文件提交到PubMLST 網站，得到每個管家基因的等位基因序號，每一株菌的等位基因序號按照指定順序排列形成它的等位基因譜，與PubMLST 數據庫中已有的管家基因譜進行比對，得到每株細菌對應的序列型（sequence type，ST）。根據菌株的ST 型在MLST分型專用網站PHYLOVIZ Online（https：//online.phyloviz.net/index/inputinfo）上構建最小生成樹［11］，得到目標菌株與其他參考菌株的親緣關系。

2 結果

2.1 細菌分離結果

從32 份環(huán)境涂抹樣本中共分離到7 株腸桿菌科細菌。其中擺盤間操作臺1 株，命名為J3；初加工間地面4 株，命名為J2、J8、J10 和J13；擺盤間地面2 株，命名為J9 和J19。（見表2）。

表2 7 株腸桿菌科細菌的鑒定結果和來源

2.2 生化鑒定和16S rDNA 測序結果

7 株腸桿菌科細菌的生化鑒定結果與16S rDNA 測序比對結果一致。其中J2 為陰溝腸桿菌，J10 為河生腸桿菌，J3 和J19 為肺炎克雷伯菌，J8、J9、J13 為產酸克雷伯菌。（見表2）。

2.3 MLST 分型結果及建樹

3 株產酸克雷伯菌（J8、J9、J13）的等位基因編號和MLST 分型結果見表3，分別為3 種不同的ST 型：菌株J8 為ST277、菌株J9 為ST126、菌株J13 為ST160。

表3 3 株產酸克雷伯菌的MLST 分型結果

在https：//online.phyloviz.net/index/inputinfo 網站上構建的最小生成樹（如圖1）顯示，分離自初加工間地面的J8（ST277）和J13（ST160）遺傳距離較近，它們與分離自擺盤間地面的J9（ST126）遺傳距離較遠。

圖1 根據產酸克雷伯菌數據庫構建的ST 型最小生成樹

3 討論

本研究采用海綿涂抹法采集航空食品生產環(huán)境中的環(huán)境樣品，未分離到致病菌。培養(yǎng)鑒定腸桿菌科細菌7 株，其中初加工間地面分離出1 株陰溝腸桿菌（J2）、1 株河生腸桿菌（J10）和2 株產酸克雷伯菌（J8、J13），擺盤間操作臺分離出1 株肺炎克雷伯菌（J3），擺盤間地面分離出1 株產酸克雷伯菌（J9）和1 株肺炎克雷伯菌（J19）。這些細菌屬于條件致病菌，它們廣泛存在于自然環(huán)境和人體中，一般情況下不會導致疾病，但在免疫力低下的特殊人群中，這些細菌也會導致嚴重感染。航空食品生產車間中的這些條件致病菌可能來自未清洗干凈的食品原材料、餐具、運輸工具以及操作人員的呼吸道、皮膚。從初加工車間分離到的腸桿菌科細菌數量和種類較多，可能與初加工車間處理未消毒加工的食品原材料種類和數量較多有關，因此為了避免外來食品原材料和運輸工具將病原菌帶入航食車間，初加工車間的分區(qū)管理和單向流程管理非常重要。各車間內地面分離到的腸桿菌科細菌數量和種類多于操作臺面和推車，因此為避免地面細菌污染航食，應加強對操作人員的規(guī)范操作和衛(wèi)生知識培訓，每日生產結束后要徹底清潔操作臺和地面。

由于鑒定出的腸桿菌科細菌種類不一，且個別菌種的菌株數量太少，MLST 分型意義不大。因此本研究采用MLST 方法僅對3 株產酸克雷伯菌株進行了分型分析，3 株菌株分別屬于3 個型別：ST277（J8）、ST160（J13）和ST126（J9），表明這3 株菌的來源可能不同。本研究基于產酸克雷伯菌的MLST 數據庫，將所有已發(fā)現的ST 型別進行建樹，并標記出了本研究檢出的3 株產酸克雷伯菌的ST 型別（見圖1）。結果顯示J8 和J13 存在較近的遺傳進化關系，而且J8 和J13 皆從初加工間地面采集而來，表明它們既可能來源于相似的外界環(huán)境，也可能長期定殖于初加工車間并存在進化關系。Izdebski 等［12］曾從ICU 康復患者體內分離到產酸克雷伯菌ST160型，該型別曾發(fā)生于醫(yī)院感染與臨床關系密切相關。Cosic 等［13］從活性污泥、地表水、植物根系、土壤、超市和肉店的食品中共檢出63 株產酸克雷伯菌并對其進行MLST 分型研究，他們在雞肉制品中分離出1 株產酸克雷伯菌ST126，這提示本研究所得到的菌株J9 可能來源于肉類食品。根據腸桿菌科細菌的鑒定結果以及3 株產酸克雷伯菌的分型結果，航空食品生產企業(yè)需對這些條件致病菌以及致病菌建立預防措施，首先應采購質量合格的食品原材料，尤其是半成品原材料（如半成品肉類）；其次應做好原材料的清洗消毒工作，尤其是果蔬類原材料；還要對砧板以及桌面、地面進行消毒工作，并且在完成工作后，要對生產車間進行徹底消毒。

航空食品具有高蛋白、高糖、生冷食物較多、成分復雜、易腐敗等特點。食品從生產到旅客食用時間較長，流程復雜、環(huán)節(jié)眾多，整個過程短則幾個小時，長則幾十個小時，如果控制不當，極易滋生細菌，導致食品變質。同時，航空食品為了達到新鮮、營養(yǎng)、安全的要求，其生產和運輸過程要求嚴格控制溫度，這對企業(yè)的設施設備和管理能力要求較高，在制作和管理方面比一般食品要求更嚴格［14-15］。介于航空食品高風險高成本的特點，《GB 31641-2016 食品安全國家標準 航空食品衛(wèi)生規(guī)范》［16］中，不僅要求對航空食品的成品和半成品進行微生物監(jiān)控，對航空食品生產環(huán)境中微生物也需要進行監(jiān)控。在航空食品生產車間的清潔作業(yè)區(qū)進行菌落總數監(jiān)測，對食品接觸表面如食品加工設備、操作臺等進行大腸埃希菌、霉菌監(jiān)測，必要時開展致病菌的監(jiān)控。本研究采用海綿涂抹法采集航空食品生產環(huán)境中的環(huán)境樣品，未分離到致病菌，但分離到了腸桿菌科的條件致病菌。這些條件致病菌一方面反映了車間內不同環(huán)境的衛(wèi)生條件差異，也提示了航空食品存在的潛在風險，對航空食品企業(yè)進一步改進管理流程，降低食品安全風險具有參考價值。