江連洲，蘇睿涵，張雪晴，馮玉田，孫 娜

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)凝膠狀物質(zhì)或沉淀[1-2]，通過(guò)對(duì)這種物質(zhì)的成分及形成機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)疏水作用是不溶性聚集體形成的主要機(jī)制，但也不排除少量其他作用（如轉(zhuǎn)肽作用、離子鍵等）的存在。這種形成不溶性聚集體的反應(yīng)可引起肽結(jié)構(gòu)改變，改善肽的生物活性[3]。產(chǎn)生的不溶性聚集體被認(rèn)為是酶水解過(guò)程中的副產(chǎn)物，可降低蛋白質(zhì)水解效率。這種不溶性聚集體中氨基酸含量豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。ZHANG 等[4]將大米蛋白水解產(chǎn)生的不溶性聚集體進(jìn)行超聲處理，制備出具有抗氧化性的Pickering 乳液。DU 等[5]用酶解羊奶酪蛋白所產(chǎn)生的不溶性聚集體制備納米顆粒用于運(yùn)載姜黃素。

大豆肽是大豆蛋白水解產(chǎn)生的多種肽的混合物，氨基酸組成與大豆蛋白幾乎相同，但大豆肽的致敏性更低，且較大豆蛋白更易被消化吸收。同時(shí)大豆肽還具有抗氧化、抗衰老、平衡腸道菌群、降低膽固醇、改善新陳代謝和提升免疫力等生理活性[6]，對(duì)人體健康具有重要作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)大豆肽不溶性聚集體的功能性質(zhì)及其在食品中的應(yīng)用展開(kāi)了深入研究。本文綜述了大豆肽不溶性聚集體的形成機(jī)制、影響因素、功能特性及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，為肽不溶性聚集體的深入研究及在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用拓展提供了理論基礎(chǔ)。

1 不溶性聚集體形成機(jī)制

在蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成小分子肽或游離氨基酸的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生溶解性較差的聚集體（一種類蛋白凝膠狀物質(zhì)）。1974 年，ASO 等[7]提出疏水作用是影響不溶性聚集體形成的重要因素。1976年，HOFSTEN 等[8]提出plastein 反應(yīng)是一種重排過(guò)程，小分子肽通過(guò)非共價(jià)鍵連接，轉(zhuǎn)肽和水解所起到的作用較縮合更重要。GONCA 等[9]借助實(shí)驗(yàn)證實(shí)plastein 反應(yīng)只涉及疏水作用和離子鍵機(jī)制，未檢測(cè)到肽鍵的形成和轉(zhuǎn)肽作用。因此，plastein反應(yīng)過(guò)程中可能存在疏水、轉(zhuǎn)肽、水解和離子鍵等多種作用，其具體形成機(jī)制仍有待深入研究。目前疏水作用被認(rèn)為是不溶性聚集體形成的主要機(jī)制。

不溶性聚集體的形成過(guò)程可分為3 個(gè)步驟，①蛋白酶水解蛋白質(zhì)形成不同分子質(zhì)量的短肽和游離氨基酸[10]；②通過(guò)蒸發(fā)、冷凍干燥或噴霧干燥濃縮水解產(chǎn)物；③在高底物濃度（30%～50%）下采用相同或不同的酶孵育水解產(chǎn)物[2]（見(jiàn)圖1）。LIU等[11]通過(guò)對(duì)乳清蛋白水解進(jìn)行研究提出不溶性聚集體的形成分為2 個(gè)步驟，①在0.5 h 內(nèi)形成具有疏水核心的蛋白結(jié)構(gòu)；②這些結(jié)構(gòu)聚集在一起，較小的結(jié)構(gòu)也參與聚合。

圖1 不溶性聚集體形成機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)，不溶性聚集體的產(chǎn)生與疏水相互作用及離子鍵有關(guān)。

2 影響不溶性聚集體形成的因素

2.1 物理及化學(xué)因素

蛋白質(zhì)水解過(guò)程中，pH、溫度及其他物質(zhì)的添加等理化因素通過(guò)影響酶活性或多肽結(jié)構(gòu)對(duì)不溶性聚集體的形成產(chǎn)生影響。由于蛋白酶種類不同，能使聚集體達(dá)到最高產(chǎn)率的pH 也不同（3.0-11.0）[9]。堿性環(huán)境下，大豆肽不溶性聚集體的產(chǎn)率降低[12]，酸性環(huán)境是否影響其產(chǎn)率尚待研究。此外，溫度也是重要影響因素。ZHAO 等[13]研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度越高，不溶性聚集體生成速率越快，但產(chǎn)率會(huì)隨之降低。研究表明，不溶性聚集體的形成除受酶活性影響外，還與其自身表面疏水性及其他物質(zhì)（如多肽、多糖、鹽、脂類等）的添加等因素有關(guān)[14]。

2.2 酶的種類

蛋白質(zhì)水解程度隨酶的種類不同各異，對(duì)不溶性聚集體的產(chǎn)生影響較大。研究表明含有疏水基團(tuán)的蛋白酶更易誘導(dǎo)聚集體形成。LI 等[15]研究發(fā)現(xiàn)Alcalase 堿性蛋白酶較木瓜蛋白酶更易促進(jìn)不溶性聚集體的形成。趙明等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在相同處理?xiàng)l件下，風(fēng)味蛋白酶較堿性蛋白酶和中性蛋白酶產(chǎn)生更多的不溶性聚集體。也有學(xué)者指出胰蛋白酶不能使大豆肽產(chǎn)生聚集體[17]。

2.3 底物

蛋白質(zhì)水解過(guò)程中，底物種類和濃度不同可導(dǎo)致聚集體產(chǎn)率存在差異。趙明等[16]采用相同酶分別水解β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）時(shí)，相應(yīng)聚集體產(chǎn)率存在差異。SUKAN 等[18]采用胃蛋白酶水解真菌蛋白和酪蛋白，其中水解酪蛋白得到的不溶性聚集體產(chǎn)率較真菌蛋白高14%。SHUN 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨著底物濃度增加，不溶性聚集體產(chǎn)率呈指數(shù)增長(zhǎng)。因此，可以推測(cè)不同底物種類和濃度是影響不溶性聚集體產(chǎn)率的主要因素，且這種影響可能與底物中疏水性氨基酸含量有關(guān)。

3 大豆肽不溶性聚集體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能特性

大豆蛋白是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富且具有良好功能特性的蛋白質(zhì)，其被不完全水解后產(chǎn)生的大豆肽作為功能性肽被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域。大豆蛋白在水解過(guò)程中由于疏水作用發(fā)生聚集，產(chǎn)生大豆肽不溶性聚集體。大豆肽不溶性聚集體的掃描電子顯微鏡圖像[16]如圖2 所示。蛋白形成聚集體后，其組成及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功能特性發(fā)生改變。

圖2 大豆肽不溶性聚集體掃描電子顯微鏡圖像

3.1 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值

與大豆分離蛋白（SPI）相較，大豆肽不溶性聚集體中的Thr、Val、Ala、Leu、Ile、Tyr、Phe、Pro、Met 和Cys 比例顯著升高（p ＜0.05），Glu 和Asp 比例顯著降低，其他氨基酸如Ser、His、Lys和Arg 的含量無(wú)顯著差異（p ＞0.05）[20]。Val、Ala、Leu、Ile、Phe、Tyr 和Pro 均為疏水性氨基酸，因此大豆肽不溶性聚集體中的疏水性氨基酸含量較高，其占比超過(guò)40%。此外，大豆肽不溶性聚集體中的必需氨基酸含量也高于SPI，其占比達(dá)38%。進(jìn)一步表明不溶性聚集體的形成是由于蛋白質(zhì)被酶水解時(shí)氨基酸間發(fā)生疏水相互作用，疏水性氨基酸聚集形成凝膠或沉淀。所形成的大豆肽不溶性聚集體中必需氨基酸含量豐富，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3.2 功能特性

UDENIGWE 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與SPI 相較，大豆肽不溶性聚集體表現(xiàn)出較好的抗胃消化特性和良好的抗氧化活性，但在腸道中易被消化，可作為姜黃素等生物活性物質(zhì)的遞送載體[22]。此外，大豆肽不溶性聚集體還具有良好的鹽離子穩(wěn)定性[23]。研究發(fā)現(xiàn)，物理化學(xué)改性會(huì)對(duì)大豆肽不溶性聚集體的結(jié)構(gòu)及功能特性產(chǎn)生影響，進(jìn)而拓寬其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。趙明[16]采用均質(zhì)和pH 偏移方法處理不溶性聚集體，使其溶解度提升，改性后的不溶性聚集體的乳化性優(yōu)于SPI，且經(jīng)pH 偏移處理的不溶性聚集體所制備的乳液具有良好的貯藏穩(wěn)定性[24]。經(jīng)超聲處理后的大豆肽不溶性聚集體的抗氧化能力良好，與表面活性劑HPMC/Tween 80 混合后提升了乳化能力，可作為一種雙功能乳化劑[25]。

4 大豆肽不溶性聚集體在食品中的應(yīng)用

4.1 營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用

大豆肽不溶性聚集體中含有大量必需氨基酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富。此外，還可通過(guò)摻入所需氨基酸的方式賦予其特定營(yíng)養(yǎng)，提高大豆肽不溶性聚集體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值（見(jiàn)圖3（a））。如在大豆肽不溶性聚集體中添加蛋氨酸用作蝦飼料可有效促進(jìn)幼蝦生長(zhǎng)[26]。也可通過(guò)添加半胱氨酸提升大豆肽不溶性聚集體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，合成理想蛋白質(zhì)[27]。與游離氨基酸相較，將所需氨基酸摻入肽聚集體中更易被人體吸收利用。氨基酸摻入的方法還可提升蛋白水解物的抗炎活性[28]。但由于該種方法成本較高，且產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性具有可替代性，因此未被廣泛應(yīng)用。

圖3 大豆肽不溶性聚集體特定氨基酸摻入反應(yīng)機(jī)制及脫苦機(jī)制

4.2 脫苦應(yīng)用

大豆蛋白的水解物通常含有苦味，限制了其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。產(chǎn)生的苦味與其氨基酸序列有關(guān)。目前采用物理、化學(xué)及生物方法在蛋白質(zhì)水解時(shí)可抑制苦味肽生成，減少蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物苦味。生物脫苦可在保證脫苦效果的同時(shí)降低脫苦成本。在酶水解過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露。LIAO 等[29]研究表明肽中疏水基團(tuán)種類和數(shù)量可影響苦味閾值，具有高疏水性側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸包括Trp、Tyr、Phe、Leu、Ile、Val、Pro。ISHIBASHI 等[30]研究證實(shí)，增加Phe 或Tyr 比例可引起苦味強(qiáng)度提升，苦味與肽疏水性及疏水性氨基酸含量呈正相關(guān)[31]。大豆肽不溶性聚集體中疏水性氨基酸占比為40%～45%。如圖3（b）所示[32]，在蛋白酶水解過(guò)程中氨基酸間由于疏水作用發(fā)生聚集，形成將疏水性氨基酸包裹在內(nèi)的聚集體，減小味覺(jué)對(duì)苦味的感知，這就是不溶性聚集體的形成可用來(lái)脫苦的原因[33]。

4.3 活性物質(zhì)遞送及其他應(yīng)用

不溶性聚集體是大豆肽生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物。ZHANG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)這種不溶性聚集體含有較高比例的必需氨基酸，且在消化過(guò)程中可釋放小肽和氨基酸，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。為了避免資源浪費(fèi)，如何有效利用不溶性聚集體成為新的研究方向。通過(guò)理化手段將不溶性聚集體進(jìn)行改性可顯著提升其溶解度、乳化性、貯藏穩(wěn)定性及抗氧化能力等[9,23-24]。

由圖4 可知，改性后的大豆肽不溶性聚集體可用于活性物質(zhì)的遞送。ZHANG 等[22]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)pH 偏移處理的不溶性聚集體在遞送姜黃素時(shí)表現(xiàn)出良好的模擬胃腸消化穩(wěn)定性、抗氧化活性和體外生物利用度。大豆肽不溶性聚集體也可與其他物質(zhì)結(jié)合。DONG 等[34]將不溶性聚集體與EGCG 結(jié)合，制備的乳液具有更好的穩(wěn)定性。JING 等[35]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)堿性處理后的大豆肽不溶性聚集體可用于制作蛋黃醬，表現(xiàn)出良好的感官特性和穩(wěn)定性，可作為綠色食品代替?zhèn)鹘y(tǒng)蛋黃醬。改性后的大豆肽不溶性聚集體的穩(wěn)定性和乳化性提升，并可作為活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)載體，在食品領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

圖4 大豆肽不溶性聚集體的改性及應(yīng)用

5 總結(jié)與展望

大豆肽不溶性聚集體是酶解過(guò)程中的副產(chǎn)物，其形成機(jī)制仍有待深入研究。目前已知其主要聚集原因?yàn)槭杷饔?，也包含轉(zhuǎn)肽、離子鍵等其他因素作用。大豆肽不溶性聚集體含有豐富的必需氨基酸，具有良好的抗氧化活性和抗炎活性，具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，在食品領(lǐng)域中應(yīng)用前景廣闊。目前大豆肽不溶性聚集體主要用于解決生物活性肽的苦味問(wèn)題及提升營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，由其制備的水凝膠和納米顆粒還可用于生物活性物質(zhì)運(yùn)輸。大豆肽不溶性聚集體的有效利用減少了資源浪費(fèi)，為綠色生產(chǎn)及食品工業(yè)中副產(chǎn)物的有效利用奠定基礎(chǔ)。