魏敏，宋杰，劉玉，李德盛，秦俊杰，劉潘江，徐曉懷，姚順，管彬，單昕，馬欣然，孫雨綺，鄭偉

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005）

青蛤（Cyclina sinensis）俗稱黑蛤、圓蛤、牛眼蛤等[1]，廣泛分布于日本及我國南北沿海砂質(zhì)的潮間帶，主要棲息于近高潮區(qū)和中潮區(qū)有淡水匯入的河口灘涂中[2,3]，是我國重要的埋棲型暖水性經(jīng)濟(jì)型雙殼貝類。青蛤生長快、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，濾水效果好，在我國具有廣闊的養(yǎng)殖和消費(fèi)市場[4]。

目前，有關(guān)于溫度、鹽度、流速、規(guī)格和環(huán)境污染等因素對埋棲貝類潛沙行為影響的研究很多[5-9]，但不同底質(zhì)對青蛤潛沙行為的影響研究較少[10]，這對青蛤養(yǎng)殖十分不利。為了探究青蛤在不同底質(zhì)下的潛沙規(guī)律和晝夜攝食節(jié)律，找出青蛤的最佳養(yǎng)殖條件，本文從行為、生理、生長等方面，研究光照與底質(zhì)對青蛤潛沙行為、攝食規(guī)律和消化代謝的影響[11-14]。本研究通過揭示青蛤的潛沙行為過程及其與光照的關(guān)系，明確光照對其攝食和消化代謝的影響，以期為優(yōu)化青蛤養(yǎng)殖環(huán)境，提高底播增殖的存活率提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2 齡青蛤購于山東濰坊地區(qū)青蛤養(yǎng)殖場。隨機(jī)挑選一定數(shù)量健康、活力旺盛個體于室溫下（25±3）℃暫養(yǎng)一段時間后，隨機(jī)抽取近似規(guī)格的個體放入本課題組設(shè)計的養(yǎng)殖暗箱中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（水溫22 ℃），每箱放8 個個體。試驗(yàn)后解剖青蛤，取出內(nèi)臟團(tuán)，于-20 ℃冰箱中冷凍保存，用于后續(xù)酶活的測定。

實(shí)驗(yàn)用養(yǎng)殖暗箱由三個養(yǎng)殖暗箱和一套水循環(huán)系統(tǒng)組成一個單元（圖1）。養(yǎng)殖暗箱主體為玻璃缸外層包裹遮光層和隔熱隔音棉層，人工調(diào)控水溫、光照和聲音。養(yǎng)殖箱的箱蓋上安裝了LED 燈管和帶紅外線攝像功能和WIFI 模塊的相機(jī)，無論有無光照均可攝像拍照和遠(yuǎn)程傳輸。增氧和加熱裝置在養(yǎng)殖暗箱外的水循環(huán)系統(tǒng)，避免噪音和水體受熱不均勻影響?zhàn)B殖暗箱內(nèi)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖暗箱結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the structure of the experimental device

本實(shí)驗(yàn)使用的酶活測試試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 潛沙行為觀察

將在連云港贛榆區(qū)青口鹽場青蛤養(yǎng)殖池塘挖取的泥洗凈除雜，用漂白粉消毒后，陽光下曝曬晾干備用；海邊挖取的海沙不斷淘洗，用濾網(wǎng)去除大顆粒雜質(zhì)，待海沙的粒徑符合一定要求后（平均粒徑為0.125～0.250 mm），用漂白粉浸泡消毒，洗凈后晾干備用。

將泥沙按不同比例混合為四組：全泥組（含沙量0%），沙泥比1∶3 組（25%沙），沙泥比1∶1 組（50%沙）,沙泥比3∶1 組（75%沙），全沙組（100%沙），均勻平鋪在30 cm×30 cm×30 cm 的養(yǎng)殖暗箱底部10 cm 厚。注水后整個養(yǎng)殖箱沙穩(wěn)定后，放入青蛤開始實(shí)驗(yàn)，每組放入青蛤8 只，自然、均勻地灑落于底質(zhì)表面，即開始試驗(yàn)（每組重復(fù)3 次）。觀察并用攝像頭拍攝記錄青蛤的潛沙過程。通過開關(guān)養(yǎng)殖暗箱蓋上的LED 光源來模擬和觀察青蛤在有光（12 h）和無光（12 h）條件下的潛沙行為以及潛沙后的生活狀態(tài)。

1.2.2 攝食行為觀察

每組挑選8 個相同規(guī)格的青蛤在養(yǎng)殖暗箱中觀察攝食行為。每天早晚各投喂小球藻（Chlorella vulgaris）1 次，連續(xù)投喂3 d，并用攝像觀察記錄。通過定時開關(guān)（開啟：6：00；關(guān)閉：18：00）控制養(yǎng)殖暗箱蓋上的LED 光源模擬自然光照來研究青蛤攝食的晝夜節(jié)律。將其伸出水管作為攝食標(biāo)志，伸出水管時長為攝食時長。每組3 個平行，重復(fù)三次。統(tǒng)計錄像視頻中青蛤伸出水管的時間分別計算出黑天（黑暗條件）與白天（光照條件）攝食的總時長，對比得出青蛤的最適攝食時間。

1.2.3 酶活測定與分析

設(shè)置三個實(shí)驗(yàn)處理組：持續(xù)24 h 黑暗處理組（“24 D”）、持續(xù)24 h 光照處理組（“24 L”）和12 h黑暗處理后再繼續(xù)進(jìn)行12 h 光照處理組（“12 D+12 L”，模擬自然光照并作為對照組）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時分別隨機(jī)從三組中取6 只蛤，測定內(nèi)臟團(tuán)組織的消化和代謝酶（α-淀粉酶、丙酮酸激酶、胃蛋白酶、己糖激酶和乳酸脫氫酶）的酶活。具體步驟按照酶活測定試劑盒說明書進(jìn)行。使用分光光度計進(jìn)行吸光度的測定，超微量紫外分光光度計測定蛋白濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。使用Excel 軟件進(jìn)行簡單的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。用軟件SPSS 18.0 進(jìn)行多因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蛤的潛沙行為

在鹽度27、水溫22 ℃、pH8.0 的天然海水中，對錄像結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)（圖2），青蛤?qū)㈦p殼打開，依次緩慢先伸出水管再伸出斧足，此階段需時約50 min。接著青蛤把斧足伸入沙層內(nèi)，水管向上，腹緣向下，將殼豎起。隨后，青蛤通過斧足擠入沙中并開始左右擺動，每擺動一下便向下潛一小段距離，一般在20 次左右便能夠全部潛入泥沙中，水管在沙面上留下2 個小孔，至此完成潛沙。由此可知，青蛤潛沙行為過程包括五個步驟：伸出水管，伸出斧足，豎殼，鉆沙，潛沙。

圖2 青蛤潛沙完整過程Fig.2 The complete process of burrowing in the sand of clam Cydina sinesis

2.2 不同底質(zhì)和光照對青蛤潛沙的影響

觀察發(fā)現(xiàn)（表1），無論有無光照，全沙組和泥沙比3∶1 組青蛤的潛沙時間為最短。全沙組中，光照條件下青蛤潛沙時間（25.66±1.59）min 顯著低于黑暗條件下的青蛤潛沙時間。

表1 青蛤在有/無光環(huán)境下在不同底質(zhì)中潛沙時間/（min）Tab.1 Burrowing time of clam Cyclina sinensis in different sediments under light or dark environment

2.3 青蛤晝夜攝食行為分析

光照對青蛤的活動影響顯著，光照條件下（模擬白天）青蛤的攝食時長（伸出水管時長）明顯低于黑暗時（模擬黑夜），攝食時間主要集中在19：00—22：00 這個時間段（圖3-A）。

圖3 青蛤體內(nèi)酶活的測定(L-光照條件下，D-黑暗條件下）Fig.3 Determination of enzyme activity in clam (L-light condition,D-dark condition)

2.4 光照對青蛤消化和代謝的影響

24 h 黑暗的“24 D”組青蛤的α-淀粉酶和胃蛋白酶酶活顯著低于“12 D+12 L”組（P＜0.05，圖3-B），但“24 D”組青蛤的胃蛋白酶酶活顯著高于“12 D+12 L”組（P＜0.05，圖2-C）；“24 D”組青蛤的己糖激酶、乳酸脫氫酶及丙酮酸激酶酶活均顯著高于“24 L”組（P＜0.05，圖3-D、3-E 和3-F）。

3 討論

3.1 青蛤的潛沙行為

埋棲型貝類通常都具有發(fā)達(dá)的斧狀足，以挖掘泥沙，使部分或者整個身體進(jìn)入泥沙內(nèi)生活[15,16]。從泥沙表面到鉆入泥沙內(nèi)整個過程中，需要時間具有個體差異，有個青蛤只需要5 min 就能潛沙完畢，有的需要30 min 以上甚至不潛沙。經(jīng)觀察，青蛤潛沙的一個明顯特征為豎殼，健康的青蛤只要能把殼豎起來，就能潛下去，先豎殼的基本上先完成潛沙。因此認(rèn)為，青蛤潛沙快慢與其自身的健康狀態(tài)直接相關(guān)。這一結(jié)果與于志華等[10]對文蛤（Meretrix meretrix）幼苗潛沙行為有相似之處。

埋棲貝類在早期具有附著習(xí)性，后期進(jìn)行埋棲生活，評判埋棲貝類增殖放流成活率的重要因素之一就是潛沙能力[17]。潛沙所用的時間越短，埋棲的深度越深，貝類就能盡快進(jìn)入身體周圍被保護(hù)的環(huán)境，減少敵害生物的侵襲，在復(fù)雜的自然環(huán)境中提高存活率[18,19]。

底質(zhì)中泥沙比例不同對青蛤潛沙行為也有較大的影響[20]。青蛤在泥沙比3∶1 的底質(zhì)環(huán)境中潛沙時間較短，潛沙率較高，死亡率較低，表明合適的泥沙配比能為青蛤潛沙提供更好的環(huán)境。光源的有無對青蛤潛沙行為也有一定影響，但是，本實(shí)驗(yàn)觀察，有光和無光對青蛤潛沙影響并不顯著，其中在無光的環(huán)境下，青蛤潛沙時間稍短，但具體原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

3.2 青蛤的晝夜節(jié)律

行為觀察表明，光照對青蛤運(yùn)動時長的影響較為顯著（P＜0.05），黑暗條件下青蛤的運(yùn)動時長大于持續(xù)光照條件下，青蛤主要活動時間集中在黑夜，尤其是夜間19：00—22：00 時間段，而持續(xù)光照下極少活動。觀察結(jié)果暗示，光照對青蛤的行為活動具有明顯的抑制作用。持續(xù)黑暗條件下，青蛤三種糖酵解酶（已糖激酶、乳酸脫氫酶及丙酮酸激酶）酶活均顯著高于持續(xù)光照組（P＜0.05)，表明光照對青蛤的代謝同樣具有一定抑制作用。動物主要通過糖酵解及之后的三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化來產(chǎn)生ATP 供能，已糖激酶、乳酸脫氫酶及丙酮酸激酶均為糖酵解過程中關(guān)鍵酶，其中已糖激酶和丙酮酸激酶是糖酵解過程中的主要限速酶，能夠反應(yīng)動物體內(nèi)糖酵解的水平，而乳酸脫氫酶是無氧途徑的關(guān)鍵酶[21-23]。本研究中，已糖激酶和丙酮酸激酶在黑暗組和自然光照組中的酶活正好相反，暗示這兩種糖酵解限速酶在體內(nèi)可能存在一定補(bǔ)償機(jī)制。因此，推測黑暗條件下青蛤的活動顯著增加，較高的代謝活力產(chǎn)生的能量正好能夠滿足自身活動所需。

本研究中，持續(xù)黑暗組中青蛤的α-淀粉酶活性顯著低于自然光照組，而持續(xù)黑暗組中青蛤的胃蛋白酶活性顯著高于自然光照組。持續(xù)光照組中青蛤的α-淀粉酶活性顯著低于自然光照組，而持續(xù)光照組中青蛤的胃蛋白酶活性顯著高于自然光照組。藻類是濾食性貝類的主要食物。無光條件下，藻類不能進(jìn)行正常光合作用，藻體中淀粉等糖類有機(jī)物積累較少，可能導(dǎo)致貝類攝入的糖類不足而降低體內(nèi)淀粉酶（α-淀粉酶）的活性；但無光照對藻體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成并無顯著影響[24，25]，無光條件下青蛤的活動又較為頻繁，所以需要更多的能量支持機(jī)體活動，因此在藻類中糖類合成不足的情況下，推測通過提高機(jī)體內(nèi)蛋白消化酶（胃蛋白酶）的活性來消化代謝藻類中蛋白質(zhì)獲取所需機(jī)體活動能量。

3.3 總結(jié)

青蛤在泥沙比3∶1 的底質(zhì)環(huán)境中潛沙時間較短，潛沙率較高，死亡率較低，相較于其他底質(zhì)更加適合青蛤的底棲生活。在保持實(shí)驗(yàn)水溫和鹽度相同的條件下，青蛤活動的時間集中在黑暗條件下，夜里活動的時間段主要集中在19：00—22：00。青蛤的行為活動具有一定的晝夜節(jié)律，光照越弱時，青蛤的活動越頻繁，在黑暗條件下青蛤活動較為旺盛，其消化與代謝水平相對較高。