張凱，姜娓娓，萬(wàn)東杰，高亞平，張義濤，蔣增杰

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3.榮成楮島水產(chǎn)有限公司，山東 榮成 264312）

硅藻光合作用速率和有機(jī)物生產(chǎn)速率可與高等陸生植物相媲美，是重要的初級(jí)生產(chǎn)者[1，2]和生物硅的主要生產(chǎn)者，介導(dǎo)海洋生態(tài)系統(tǒng)中的硅循環(huán)，產(chǎn)生了巨大的礦質(zhì)資源，形成了重要的海洋碳匯[3]。單細(xì)胞藻類(lèi)是養(yǎng)殖雙殼貝類(lèi)幼蟲(chóng)和稚貝的最佳餌料[4]，而硅藻是浮游植物中最主要的類(lèi)群，約占沿海浮游植物物種豐富度的75%。硅藻富含二十碳五烯酸（EPA）與二十二碳六烯酸（DHA）等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸[5]。BROWN 等[6]在分析雙殼貝類(lèi)幼體發(fā)育所需的多不飽和脂肪酸的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，硅藻的多不飽和脂肪酸含量較其他藻類(lèi)占優(yōu)勢(shì)。因此，硅藻為濾食性貝類(lèi)最重要的天然餌料之一。

硅酸鹽是硅藻類(lèi)浮游植物生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素[7]。硅酸鹽是構(gòu)成硅藻硅質(zhì)細(xì)胞壁的主要成分，參與生物體蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂等多個(gè)生長(zhǎng)和代謝過(guò)程。但研究表明，我國(guó)的一些典型養(yǎng)殖海域在春季普遍缺乏硅酸鹽，例如在乳山灣西側(cè)海域，硅酸鹽濃度的變化為：秋季＞夏季＞冬季＞春季，春季硅酸鹽濃度較低[8]；在膠州灣，春季和冬季也存在著硅酸鹽限制的現(xiàn)象[9]。桑溝灣是我國(guó)北方典型的貝類(lèi)規(guī)?；B(yǎng)殖海灣，養(yǎng)殖長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）和櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的年產(chǎn)量達(dá)60 000 t 和15 000 t[10,11]。歷史資料表明，桑溝灣未產(chǎn)生硅限制的季節(jié)為夏季，其硅酸鹽濃度變化范圍為2.20～16.34 μmol/L[28-30]，產(chǎn)生硅限制的季節(jié)為：①秋季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～13.28 μmol/L[25,28-30]，但大部分調(diào)查站位的硅酸鹽濃度高于絕對(duì)閾值，只有少部分調(diào)查站位的硅酸鹽濃度低于絕對(duì)閾值；②冬季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～24.44 μmol/L[25,28-30]，冬季硅酸鹽濃度平均值遠(yuǎn)高于絕對(duì)閾值2 μmol/L；③春季，其硅酸鹽濃度變化范圍為0～1.82 μmol/L，低于絕對(duì)閾值2 μmol/L，存在硅酸鹽限制現(xiàn)象，硅酸鹽濃度可能已經(jīng)成為桑溝灣春季影響浮游植物生長(zhǎng)的主要限制因子之一[12,24,25,28-30]。

春季是濾食性貝類(lèi)等養(yǎng)殖生物的快速生長(zhǎng)期，此時(shí)若養(yǎng)殖海域發(fā)生硅酸鹽限制，將會(huì)影響?zhàn)B殖海域硅藻類(lèi)浮游植物的生長(zhǎng)[27]，進(jìn)而影響以浮游植物為食的養(yǎng)殖生物生長(zhǎng)[9,13]。本研究采用現(xiàn)場(chǎng)陸基圍隔實(shí)驗(yàn)法，探討和分析春季添加不同濃度硅酸鹽對(duì)桑溝灣原位海水中浮游植物豐度（以葉綠素a 濃度表征）、粒徑結(jié)構(gòu)以及群落結(jié)構(gòu)等影響，以期為探索養(yǎng)殖水域關(guān)鍵時(shí)段補(bǔ)充硅元素策略，提升浮游植物初級(jí)生產(chǎn)力和貝類(lèi)養(yǎng)殖容量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 方法

2021 年5 月12—19 日在山東榮成桑溝灣楮島碼頭建成長(zhǎng)200 cm、寬160 cm、高120 cm，容積約3 800 L 的長(zhǎng)方體陸基圍隔。圍隔由外周鐵框架、不透水帆布的圍隔幔和實(shí)驗(yàn)單元組成。進(jìn)水口位于圍隔幔底部，出水口位于圍隔幔上層，略低于水面，圍隔內(nèi)海水溫度與自然海水溫度一致。每個(gè)實(shí)驗(yàn)單元由上層開(kāi)口、體積為100 L 的直筒型透明聚乙烯袋制成，開(kāi)口處以方形PVC 塑料管保持形狀，用麻繩將其固定后懸掛在圍隔內(nèi)水面以上10 cm 處（圖1）。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理組，每組三個(gè)平行：①自然海水組（對(duì)照組）1.41 μmol/L SiO3-Si；②低濃度組（LS 組）20.00 μmol/L SiO3-Si；③高濃度組（HS 組）100.00 μmol/L SiO3-Si；泵取桑溝灣近岸表層海水70 L，經(jīng)200 μm 篩絹過(guò)濾后注入實(shí)驗(yàn)單元。實(shí)驗(yàn)單元內(nèi)的水體不與外部水體交換，每個(gè)實(shí)驗(yàn)單元中均配置2 W的小型抽水泵，保持海水始終處于混勻狀態(tài)，添加的硅酸鹽為九水硅酸鈉（分析純）。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間7 d，分別于第0 d、1 d、3 d、5 d、7 d 取樣，每天8：00、12：00 和17：00 測(cè)定溫度、光照強(qiáng)度等環(huán)境因子。

圖1 圍隔實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the enclosures used in the experiment

樣品采集前，緩慢攪拌實(shí)驗(yàn)單元內(nèi)的水體，保證采集樣品的均勻性。利用YSI（ProODO）型多參數(shù)水質(zhì)分析儀（YSI 公司，美國(guó)）進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溫度、光照強(qiáng)度等環(huán)境因子。

葉綠素a 采用分光光度法測(cè)定，先后使用20 μm 篩絹、2 μm、0.45 μm 醋酸纖維濾膜現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾海水1 L，分別用于表征小型浮游植物（粒徑20～200 μm），微型浮游植物（粒徑2～20 μm），微微型浮游植物（粒徑0.45～2.00 μm）葉綠素a 濃度，濾膜于-20 ℃避光冷凍保存，測(cè)定方法參考GB 17378.7-2007；濾液加入三氯甲烷固定后，-20 ℃冷凍保存。水樣在實(shí)驗(yàn)室由德國(guó)Seal QUAATRO 營(yíng)養(yǎng)鹽自動(dòng)分析儀測(cè)定，測(cè)定方法參考GB 17378.4-2007。

浮游植物細(xì)胞豐度的測(cè)定方法是：取1 L 海水樣品加入10 mL 魯哥氏液固定保存，采集方法參照《海洋調(diào)查規(guī)范—海洋生物調(diào)查》（GB/T 12763-2007），用顯微鏡（OLYMPUS BX51）分類(lèi)鑒定浮游植物，統(tǒng)計(jì)數(shù)量。浮游植物多樣性指數(shù)、物種均勻度和物種豐富度指數(shù)采用以下公式計(jì)算[26]：

物種多樣性指數(shù)采用香農(nóng)-威爾多樣性指數(shù)（H′,Shannon-Weaver index）:

物種均勻度采用Pielou 指數(shù)（J）:

物種豐富度指數(shù)采用Margalef 指數(shù)（d）:

式中，N 為某個(gè)樣品中所有物種的總個(gè)體數(shù)；Pi為某個(gè)樣品中第i 種的個(gè)體數(shù)與該樣品個(gè)體數(shù)的比值；S 為某個(gè)樣品中的總物種數(shù)；Ni為所有樣品中第i 種的總個(gè)體數(shù)。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用Graphpad prism 7.0 軟件處理數(shù)據(jù)，繪制圖表。不同處理組間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Tukey 多重比較處理。圖中“*”表示與對(duì)照組間存在顯著差異（P＜0.05），“**”表示與對(duì)照組間存在極顯著差異（P ＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)期間水體理化環(huán)境因素變化特征

實(shí)驗(yàn)期間，水溫變化在13.83～16.96 ℃之間，各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖2-A）。受陰雨天氣影響，第0～3 d 光照強(qiáng)度從981.30 μmol/m2/s 降到252.20 μmol/m2/s，隨后有所回升，在第7 d 時(shí)因陰雨降到221.10 μmol/m2/s；各實(shí)驗(yàn)組間光照強(qiáng)度無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖2-B）。

圖2 實(shí)驗(yàn)圍隔水體環(huán)境參數(shù)變化特征Fig.2 Variations in environmental parameters in the experimental land-based enclosure

浮游植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收使各圍隔內(nèi)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度逐漸降低（圖3）。對(duì)照組在第0 d 時(shí)硅酸鹽濃度為1.41 μmol/L（低于閾值2 μmol/L），總?cè)芙鈶B(tài)無(wú)機(jī)氮濃度為5.60 μmol/L，磷酸鹽濃度為0.36 μmol/L，硅氮比為0.25，小于1；硅磷比為3.92，小于10，對(duì)照組處于硅限制狀態(tài)（圖3-A、B、F）。至第7 d 時(shí)，浮游植物的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致磷酸鹽快速消耗，并低于閾值0.03 μmol/L（圖3-F）。總?cè)芙鈶B(tài)無(wú)機(jī)氮（包括硝酸鹽、亞硝酸鹽和氨氮）濃度隨時(shí)間推移逐漸降低，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)總?cè)芙鈶B(tài)無(wú)機(jī)氮濃度均高于1 μmol/L，第5 d、7 d 時(shí)LS 和HS 組顯著低于對(duì)照組（P＜0.01，圖3-B）。氨氮濃度隨時(shí)間推移逐漸降低，但LS 組和HS 組的氨氮濃度與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖3-C）。從第3 d 開(kāi)始，LS 組和HS 組的硝酸鹽濃度低于對(duì)照組，從第5 d 開(kāi)始顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，硝酸鹽濃度從高到低依次為：對(duì)照組、LS 組、HS 組（圖3-D）。亞硝酸鹽濃度從第1 d 開(kāi)始HS 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），LS 組雖高于對(duì)照組，但兩者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖3-E）。

圖3 圍隔實(shí)驗(yàn)水體溶解態(tài)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度變化Fig.3 Variation in dissolved nutrient concentration in the seawater in the experimental land-based enclosure

2.2 硅酸鹽加富對(duì)浮游植物粒徑結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葉綠素a 濃度范圍為1.83～4.40 μg/L，第7 d 時(shí)LS 組濃度最高；實(shí)驗(yàn)期間，從第5 d 開(kāi)始，LS 組和HS 組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），第7 d 時(shí)，LS 組和HS 組葉綠素a 濃度分別是對(duì)照組的1.95 倍和1.94 倍。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，對(duì)照組硅酸鹽濃度低于絕對(duì)閾值并不斷降低，影響浮游植物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致浮游植物細(xì)胞的沉降速率大于浮游植物的繁殖速率，因此，在第7 d 時(shí)對(duì)照組浮游植物葉綠素a 濃度與第5 d 相比有所下降（圖4-A）。LS 組自第3 d 小型浮游植物葉綠素a 濃度開(kāi)始顯著高于對(duì)照組，HS 組自第5 d 開(kāi)始顯著高于對(duì)照組（P＜0.01，圖4-B）。HS 組微型浮游植物葉綠素a 濃度從第1 d 開(kāi)始顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），第7 d 時(shí)，LS 組與HS 組極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），LS 組葉綠素a 濃度是對(duì)照組的2.34 倍，HS 組是對(duì)照組的7.50 倍，且HS 組葉綠素a 濃度是LS 組葉綠素a 濃度的3.21 倍（圖4-C）。微微型浮游植物除第3 d 外，其他時(shí)間的葉綠素a 濃度各實(shí)驗(yàn)單元之間無(wú)顯著差異（P＞0.05，圖4-D）。

圖4 圍隔實(shí)驗(yàn)水體不同粒徑浮游植物葉綠素a 濃度變化Fig.4 Variation in chlorophyll a concentration of phytoplankton with different size particles in the seawater of the experimental enclosures

2.3 硅酸鹽加富對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)的影響

桑溝灣春季原位海水（取自第0 d 的對(duì)照組）中的浮游植物主要由硅藻、甲藻、綠藻組成，共計(jì)44種，其中硅藻34 種，甲藻9 種，綠藻1 種（表1）。浮游植物種類(lèi)組成以硅藻占優(yōu)勢(shì)，約占物種豐富度的77.27%，其次是甲藻，硅藻門(mén)中小新月菱形藻、小環(huán)藻等硅藻細(xì)胞豐度較高。

表1 桑溝灣春季原位海水浮游植物物種組成及細(xì)胞豐度Tab.1 In situ seawater phytoplankton species composition and cell abundance in Sanggou Bay

實(shí)驗(yàn)期間，硅藻細(xì)胞豐度變化范圍為0.96×103～1.62×103cells/L。第7 d 時(shí)HS 組的硅藻細(xì)胞豐度最高。從第1 d 開(kāi)始，HS 組硅藻細(xì)胞豐度顯著高于對(duì)照組，從第3 d 開(kāi)始，LS 組硅藻細(xì)胞豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，LS 組和HS 組的硅藻細(xì)胞豐度分別比對(duì)照組增加了53.53%和69.77%（圖5-A）。

圖5 實(shí)驗(yàn)圍隔水體硅藻細(xì)胞豐度變化特征Fig.5 Characteristics of diatom cell abundance changes in the seawater of the experimental enclosures

硅酸鹽加富對(duì)小新月菱形藻、小環(huán)藻、圓海鏈藻等硅藻的促生長(zhǎng)效果明顯（圖5-B、C、D）。小新月菱形藻細(xì)胞豐度增加顯著，其豐度變化范圍為0.07×103～0.39×103cells/L；實(shí)驗(yàn)期間HS 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），與對(duì)照組藻細(xì)胞豐度相比平均增加181.69%（圖5-B）。從第1 d 開(kāi)始，HS 組小環(huán)藻細(xì)胞豐度顯著高于對(duì)照組，從第5 d 開(kāi)始，LS 組硅藻細(xì)胞豐度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，LS 組和HS 組的小環(huán)藻細(xì)胞豐度分別比對(duì)照組增加了200.00%和228.54%（圖5-C）。實(shí)驗(yàn)初期，圓海鏈藻的細(xì)胞豐度較低，為0.04×103cells/L，實(shí)驗(yàn)期間，與對(duì)照組相比，LS 組和HS 組藻細(xì)胞豐度增加明顯，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，LS 組和HS 組的圓海鏈藻細(xì)胞豐度分別為0.16×103cells/L 和0.19×103cells/L，分別比對(duì)照組增加了174.87%和224.79%（圖5-D）。

各實(shí)驗(yàn)組間不同浮游植物物種多樣性指數(shù)變化不大，無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖6-A）。各實(shí)驗(yàn)組的均勻度無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖6-B）。LS組和HS 組物種豐富度指數(shù)與對(duì)照組間差異性顯著（P＜0.05，圖6-C），從第1 d 開(kāi)始，HS 組豐富度指數(shù)顯著高于對(duì)照組；從第5 d 開(kāi)始，LS 組豐富度指數(shù)顯著高于對(duì)照組。

圖6 圍隔實(shí)驗(yàn)多樣性指數(shù)、均勻度與豐富度指數(shù)Fig.6 Diversity index,evenness index and enrichment index of phytoplankton in the seawater of the experimental enclosures

3 討論

硅藻是沿海浮游植物的主要類(lèi)群，目前已知種類(lèi)超過(guò)20 000 種，約占沿海浮游植物物種豐富度的75%，貢獻(xiàn)了約20%的全球初級(jí)生產(chǎn)力[1,17]。實(shí)驗(yàn)期間，硅藻細(xì)胞豐度變化范圍為0.96×103～1.62×103cells/L，與劉萍、侯興等關(guān)于桑溝灣春季浮游植物細(xì)胞豐度的研究結(jié)果一致[18，19]。春末桑溝灣硅藻等浮游植物細(xì)胞豐度較低的原因除了溫度影響以外，可能由于硅酸鹽的限制，影響近海浮游植物類(lèi)群主要優(yōu)勢(shì)種硅藻的生長(zhǎng)[12]和春季濾食性貝類(lèi)快速生長(zhǎng)，攝食活動(dòng)的增強(qiáng)影響桑溝灣貝類(lèi)養(yǎng)殖區(qū)的浮游植物細(xì)胞豐度。

本研究中，LS 組和HS 組的硅藻細(xì)胞豐度比對(duì)照組分別增加了53.53%和69.77%，表明硅酸鹽加富可顯著促進(jìn)桑溝灣春季硅藻類(lèi)浮游植物的生長(zhǎng)，而硅藻細(xì)胞豐度的增加勢(shì)必會(huì)對(duì)海水營(yíng)養(yǎng)鹽的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，藻類(lèi)健康生長(zhǎng)及生理平衡所需的氮磷硅原子比率為16∶1∶16，高DIN或者高DIN/P 有利于甲藻生長(zhǎng),而低DIN/Si 或者高硅酸鹽含量有利于硅藻在與甲藻的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[21]。實(shí)驗(yàn)中，人為硅酸鹽添加增加DIN/Si 和硅酸鹽濃度有利于硅藻在與甲藻的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)，根據(jù)Redfield 規(guī)律，任何一種營(yíng)養(yǎng)鹽加富，都可能導(dǎo)致其他營(yíng)養(yǎng)鹽濃度降低。因此，需注意磷酸鹽等其他營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的變化，避免春季添加硅酸鹽的同時(shí)，產(chǎn)生其他營(yíng)養(yǎng)鹽限制浮游植物生長(zhǎng)的現(xiàn)象。

外源物質(zhì)的添加對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)的影響可從兩方面評(píng)判。一方面，添加硅酸鹽并未影響2021 年桑溝灣春季近海浮游植物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)種組成的變化，可顯著促進(jìn)小新月菱形藻、小環(huán)藻、圓海鏈藻等優(yōu)勢(shì)種的生長(zhǎng)，尤其是小新月菱形藻，藻細(xì)胞豐度比對(duì)照組增加了181.69%。小新月菱形藻等硅藻繁殖速度快，細(xì)胞內(nèi)富含多不飽和脂肪酸，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良好的生物餌料[20]。因此，添加硅酸鹽對(duì)小新月菱形藻等硅藻的促生長(zhǎng)作用可為貝類(lèi)提供更多優(yōu)質(zhì)的天然餌料。

另一方面，本研究中至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，LS 組和HS組小型浮游植物的葉綠素a 濃度比對(duì)照組分別提升了95.66%和52.90%，第7 d 時(shí)LS 組和HS 組微型浮游植物葉綠素a 濃度分別是對(duì)照組的2.34 倍和7.50 倍。這表明硅酸鹽加富可顯著提高小型浮游植物和微型浮游植物的生物量；而硅鹽加富并未影響微微型浮游植物的生長(zhǎng)，各圍隔單元之間葉綠素a 濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。RIISGARD[14]、CRANFORD[15]和李鳳雪等[16]的研究表明，濾食性貝類(lèi)的截留效率與食物粒徑大小密切相關(guān)。濾食性貝類(lèi)如長(zhǎng)牡蠣能夠有效截留50%以上粒徑大于3 μm的顆粒、100%截留粒徑大于7 μm 的顆粒物。本研究中通過(guò)硅酸鹽加富所提高的小型浮游植物和微型浮游植物粒徑正處于濾食性貝類(lèi)的最佳攝食粒徑范圍內(nèi)，這或許可以提高春季濾食性貝類(lèi)對(duì)顆粒物的截留效率，提高貝類(lèi)的生長(zhǎng)速率。

營(yíng)養(yǎng)鹽的含量和結(jié)構(gòu)對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)和初級(jí)生產(chǎn)力水平具有重要影響。營(yíng)養(yǎng)鹽缺乏會(huì)限制浮游植物的生長(zhǎng)和繁殖，過(guò)高或結(jié)構(gòu)失衡則會(huì)影響浮游植物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，甚至?xí)l(fā)赤潮等災(zāi)害[22,23]?；诖耍罄m(xù)開(kāi)展不同硅酸鹽加富對(duì)硅藻優(yōu)勢(shì)種擴(kuò)培的影響研究，尋求硅元素補(bǔ)充的合適濃度，并尋求向自然海域補(bǔ)充硅元素的硅酸鹽的合適替代物，以期在保證生態(tài)安全、維持營(yíng)養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)平衡和生態(tài)系統(tǒng)平衡的條件下，為后續(xù)探索養(yǎng)殖水域關(guān)鍵時(shí)段硅元素補(bǔ)充策略、研發(fā)浮游植物初級(jí)生產(chǎn)力提升技術(shù)，進(jìn)而提高貝類(lèi)養(yǎng)殖容量的可能性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和有價(jià)值的參考。