羅嘉，丁鵬，高居杰，李永超，胡方圓，常亞青，趙沖

（大連海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

中間球海膽(Strongylocentrotus intermedius)由日本引進[1]后，已成為我國北方重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟物種之一[2]。中間育成是海膽工廠化繁育的重要階段[3,4]。工廠化中間育成是筏式養(yǎng)殖和底播增殖的殼徑≥1 cm 的中間球海膽苗種的重要來源。目前多采用高密度、高擁擠的養(yǎng)殖模式，苗種生長速度緩慢和抗病性差，影響生產(chǎn)效率，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。生產(chǎn)上追求苗種高密度養(yǎng)殖以提高經(jīng)濟效益[5,6]，但高密度養(yǎng)殖會抑制個體的生長[7,8]，增加個體之間的相互競爭，在部分水生動物個體中產(chǎn)生不利于其他個體的行為，如魚類的攻擊行為等[9,10]。養(yǎng)殖生物個體之間高頻率的接觸能增加疾病感染傳播的風險[11,12]。然而，降低養(yǎng)殖密度又會減少收益[13]。因此，建立一種既能保持高密度養(yǎng)殖以確保產(chǎn)業(yè)利潤最大化，又能提高海膽生長效率和抗病性的新型中間育成模式非常重要。在中間育成中，幼膽主要集中在體積較小的養(yǎng)殖水體中[14]，聚集和擁擠程度較高，水體沒有得到有效利用[15]。在保持養(yǎng)殖密度不變的條件下，降低海膽的擁擠程度能有效解決苗種生長速度緩慢的問題。Hu 等[16,17]研究發(fā)現(xiàn)，降低擁擠程度可以有效提高中間球海膽的生長速度和抗病性。其所用的海膽（殼徑大約3 cm）與本研究所用規(guī)格（殼徑大約1 cm）海膽在行為、生長等方面較為相似。因此，本文認為在保持高密度養(yǎng)殖的條件下，降低海膽幼苗的擁擠程度可能提高生長速度和抗病性。本文針對工廠化苗種生產(chǎn)的特點，通過探究不同擁擠程度對中間球海膽幼膽生存、行為、生長和抗病的影響，以期為中間球海膽中間育成生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用殼徑約1 cm 的中間球海膽由大連壯元海生態(tài)苗業(yè)股份有限公司（123°86′E，38°16′N）運至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，置于1 t水槽中充氣暫養(yǎng)1 周。暫養(yǎng)期間，水溫隨室溫變化，每三天換水一次，禁食。實驗開始前解剖觀察證實幼膽無明顯性腺組織。

1.2 方法

實驗自2020 年12 月3 日—2021 年1 月8日持續(xù)5 周。養(yǎng)殖箱長19.6 cm×寬16.8 cm×高18.5 cm（圖1），每箱24 只海膽。養(yǎng)殖箱A 不分隔、B和C 中分別設置橫向和橫向加縱向隔間，分為高擁擠組（H）、中擁擠組（M）和低擁擠組（L）三組。H 組中24 只海膽全部置于A 箱中；M 組分為上中下三層養(yǎng)殖空間，每層8 只海膽；L 組在橫向隔間的基礎上縱向隔間，每層養(yǎng)殖空間分為2×4 的小隔間，共24 個，每個小隔間放養(yǎng)1 只海膽（圖1）。

圖1 不同擁擠程度下中間球海膽的實驗裝置模式圖Fig.1 Experimental devices for Strongylocentrotus intermedius at different interactions

實驗期間，水溫為冬季正常水溫，每三天全量換水一次，足量投喂新鮮裙帶菜（Undaria pinnatifida）并充分曝氣。每個實驗組重復8 次獨立實驗（N＝8）。

實驗結束時，從每組中隨機取3 只海膽，用電子游標卡尺（Mahr Co.,Germany）和電子秤（G&G Co.,USA）分別測量殼徑和體質量，計算平均值。隨后在3 只海膽中隨機取一只解剖，測量口器長、口器重、腸重和性腺重，并留腸道做切片，觀察其發(fā)育情況，每組使用不同的海膽重復8 次（N=8）。

將解剖后的海膽（N=8）腸道在波恩氏液中保存48h[18]，使用標準切片技術連續(xù)橫切，用蘇木精和伊紅染色[19]，脫水封固制成切片后，用光學顯微鏡（Leica,Germany）觀察腸道形態(tài)、內(nèi)部微結構和細胞規(guī)格、形態(tài)，拍照[20]。

海膽管足伸出行為能反映個體活力。每組隨機取1 只海膽置于放有標尺的盒子內(nèi)，待其管足自然伸出后用相機拍照。隨機取10 根管足，用ImageJ 1.51 分別測量其殼徑（mm）和管足伸出長度（mm），按下式計算管足長/殼徑[21]。每個實驗組重復24 次獨立實驗（N=24）。

在完成海膽測量和管足伸出行為實驗一周后，在每組中另外隨機取10 只健康海膽置于裝置A 中進行攻毒實驗（圖1-A）。每個實驗組重復8 次獨立實驗（N=8）。在每個裝置A 中放入3 只殼徑1 cm 左右的死于黑嘴病的海膽尸體，每三天換水一次，保持海膽禁食狀態(tài)并曝氣。每天觀察，按下式計算每組海膽的患病率與死亡率[22]，持續(xù)5 d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對所有數(shù)據(jù)進行方差同質性和正態(tài)分布檢驗。符合正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析判斷其顯著性，進而用LSD（Least-Significant Difference）檢驗分析各組之間的差異性?？谄髦夭环戏讲铨R性，管足長/殼徑不符合正態(tài)分布。這兩個性狀采用非參數(shù)檢驗中的Jonckheere-Terpstra 檢驗分析組間的差異性。本實驗所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 19.0 分析軟件完成，差異顯著性為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 殼徑和體質量

經(jīng)過5 周的實驗，高擁擠組海膽的殼徑（15.53±1.68）cm 顯著低于中擁擠組（16.64±1.12）cm（P＜0.05），極顯著低于低擁擠組（17.18±1.51）cm（P＜0.01）；中擁擠組海膽的殼徑與低擁擠組無顯著差異（P＞0.05，圖2-a）。高擁擠組海膽的體質量（2.01±0.56）g 顯著低于中擁擠組（2.28±0.34）g（P＜0.05），極顯著低于低擁擠組（2.57±0.59）g（P＜0.01）；中擁擠組海膽的體質量與低擁擠組無顯著差異（P＞0.05，圖2-b）。

圖2 不同擁擠程度下中間球海膽的殼徑和體質量（平均值±標準差，N=8）Fig.2 Test diameter and body weight of sea urchin Strongylocentrotus intermedius exposed to different crowded conditions(mean±SD,N=8).

2.2 口器長、口器重、性腺重和腸重

中擁擠組海膽的口器長（5.01±0.29）cm 極顯著低于低擁擠組（5.67±0.19）cm（P＜0.01，圖3-a）。各組間口器重無顯著差異（P＞0.05，圖3-b）。各組間性腺重無顯著差異（P＞0.05，圖3-c）。高擁擠組海膽的腸重（0.07±0.03）g 極顯著低于低擁擠組（0.14±0.07）g（P＜0.01，圖3-d）。

圖3 不同擁擠程度下中間球海膽的口器長、口器重、性腺重和腸重（平均值±標準差，N=8）Fig.3 Lantern length,lantern weight,gonad weight and gut weight of sea urchin Strongylocentrotus intermedius exposed to different crowded conditions(mean±SD,N=8)

2.3 腸道結構

高擁擠組海膽的腸道環(huán)狀皺襞內(nèi)部微結構松散，組織空化嚴重，細胞腫脹，變形甚至消失（圖4-A）。中擁擠組環(huán)狀皺襞內(nèi)部微結構松散程度和組織空化程度較低（圖4-B）。低擁擠組環(huán)狀皺襞排列整齊，幾乎無組織空化，細胞形態(tài)正常（圖4-C）。

2.4 管足長/殼徑

經(jīng)過5 周實驗，各組海膽管足長/殼徑之間均無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 攻毒實驗后海膽的患病率和死亡率

攻毒實驗后，高擁擠組（67.14±14.96）%和中擁擠組海膽（57.5±13.89）%的患病率均極顯著高于低擁擠組（21.25±13.56）%（P＜0.001，圖5）。各組海膽死亡個數(shù)均約為1，死亡率沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同組中間球海膽攻毒實驗中的患病率（平均值±標準差，N=8）Fig.5 Morbidity of sea urchin Strongylocentrotus intermedius exposed to different crowded conditions(mean ± SD,N=8)

3 討論

3.1 擁擠程度對海膽體尺和消化器官的影響

口器和腸道是海膽主要的攝食和消化器官，其發(fā)育影響海膽對食物攝取和消化能力[20,23]。低擁擠組海膽的口器顯著長于中擁擠組；高擁擠組海膽腸道內(nèi)環(huán)狀皺襞內(nèi)部微結構松散，組織空化嚴重，腸重顯著低于低擁擠組。低擁擠組環(huán)狀皺襞排列整齊，幾乎無組織空化。這表明處于低擁擠環(huán)境下的海膽攝食能力可能比中、高擁擠好；低擁擠程度環(huán)境中的海膽個體體尺和消化器官發(fā)育更好，利用食物的能力更強。這說明低擁擠程度下的海膽幼苗擁有更強的攝食能力和利用食物的能力。在相同投喂量餌料下，低擁擠程度下的海膽幼苗對餌料利用效率更高。降低苗種擁擠程度可以節(jié)省餌料，提高經(jīng)濟效益，這對餌料稀缺的苗種生產(chǎn)時期非常重要[24-26]。

高擁擠組海膽的殼徑和體質量顯著低于低擁擠組和中擁擠組。這表明擁擠程度對海膽幼膽的生長影響較大，降低海膽幼苗的擁擠程度可以顯著地提高其生長速度。低擁擠組海膽的攝食行為和攝食器官發(fā)育顯著優(yōu)于高擁擠組，這解釋了低擁擠組海膽的生長優(yōu)勢。本文在Hu 等[16]的研究基礎上進一步說明了低擁擠程度有利于中間球海膽幼膽體尺的生長，表明其在海膽中間育成技術體系中的應用潛力。目前，生產(chǎn)上多采用高擁擠、高密度的養(yǎng)殖模式。這種低效利用水體的模式使海膽幼苗受到高擁擠的影響而生長緩慢。提升海膽的生長速度是增加經(jīng)濟效益的關鍵[27-29]。研發(fā)新型裝置，降低擁擠程度對幼膽生長的影響，可以在保持高密度中間育成的情況下優(yōu)化幼膽的攝食行為、攝食器官發(fā)育和生長速度，顯著提升養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。

3.2 擁擠程度對海膽抗病性的影響

在攻毒實驗中，高、中擁擠組的海膽患病率顯著高于低擁擠組，各組死亡率沒有顯著差異。這表明在低擁擠下生產(chǎn)的海膽苗種抗病性顯著強于高擁擠個體，降低擁擠程度能提高中間球海膽幼膽的抗病性。在Hu 等[17]的基礎上說明降低擁擠程度對不同規(guī)格海膽的抗病性均有影響。攻毒實驗時間較短可能是各組海膽患病率差異顯著，但幾乎沒有海膽個體死亡的原因。近年來，筏式養(yǎng)殖作為中間球海膽的重要養(yǎng)殖方式[21]在高溫水域中損失嚴重。持續(xù)性高溫無法避免，工廠化生產(chǎn)的海膽苗種在海上經(jīng)過幾個月的養(yǎng)殖后便大量患病死亡[30-32]。底播增殖作為中間球海膽的另一個重要養(yǎng)殖方式，生產(chǎn)過程中海膽死亡率同樣很高。這與中間育成中高擁擠下的苗種抗病性弱有關。因此，幼膽的抗病性決定了后續(xù)養(yǎng)殖中海膽的成活率和養(yǎng)殖效率。養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)急需抗病性強的苗種以減小養(yǎng)殖過程中海膽的患病率與死亡率。中間育成中低擁擠下的幼膽在抗病性方面表現(xiàn)顯著更好，能為后續(xù)筏式養(yǎng)殖和底播增殖提供更多抗病性強的苗種。

3.3 減少擁擠程度的生產(chǎn)應用

在海膽生產(chǎn)中，養(yǎng)殖器材多采用塑料制品。通過增加隔間或在同一水體不同水層中增設養(yǎng)殖器材，能以低成本實現(xiàn)減小海膽擁擠的功能。此外，本研究提出的新型養(yǎng)殖模式設計精巧，所需人力成本較低。在生產(chǎn)應用中，實現(xiàn)減小擁擠的功能所需投入材料和人工成本低，操作簡單且適用的方法較多，適合在生產(chǎn)中廣泛推廣。

本文通過研究不同擁擠程度對中間球海膽幼膽行為、生長和抗病的影響，提出一種新型的高密度、低擁擠的海膽中間育成養(yǎng)殖模式。該模式適用于工廠化養(yǎng)殖。處于低擁擠環(huán)境下的海膽幼苗對餌料利用更好，生長速度更快，能顯著提升中間育成效率，產(chǎn)出的海膽個體抗病性更強，為后續(xù)海膽的筏式養(yǎng)殖和底播增殖提供大量優(yōu)質苗種。