張瑋嵐，杜瑞雪，葉元土，肖旭全

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123）

飼喂蠶豆（Vicia faba）可使草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質(zhì)變爽脆、緊實(shí)、有型而不易煮爛的獨(dú)特養(yǎng)殖方式備受推廣及關(guān)注。這種養(yǎng)殖類型的草魚外形與普通草魚差異不顯著，但肉質(zhì)已發(fā)生顯著變化，廣東稱之為“脆肉鯇”[1]。廣東省中山市東升鎮(zhèn)已成為全國(guó)脆肉鯇之鄉(xiāng)。脆肉鯇獨(dú)特的口味，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受大眾青睞。相關(guān)研究主要集中在探討脆肉鯇肌肉質(zhì)構(gòu)特性、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分、血液生化指標(biāo)等，關(guān)于蠶豆如何引起草魚肌肉脆化的機(jī)理也有報(bào)道和不同的探討。有研究認(rèn)為，肌肉的脆化和嫩度與肌肉結(jié)締組織中膠原蛋白的含量有一定的相關(guān)性[2,3]；劉邦輝等[4]研究發(fā)現(xiàn)，脆化后的草魚肌肉的膠原蛋白含量會(huì)有所增加；冷向軍等[5]研究了蠶豆對(duì)草魚生長(zhǎng)和肉質(zhì)的影響，表明膠原蛋白含量與肌肉耐折力存在相關(guān)性。

石蠟切片技術(shù)中常用的蘇木精伊紅（HE）染色難用不同顏色將膠原纖維和肌纖維區(qū)分開，但Masson 染色法可實(shí)現(xiàn)[6]。根據(jù)器官組織的滲透性不同，選擇分子大小不同的陰離子染料染色。分子量小的陰離子染料易穿透紅細(xì)胞等結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織；分子量大的陰離子染料只能進(jìn)入膠原纖維等結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的組織。最終把膠原纖維染成藍(lán)色，把肌纖維染成紅色。再結(jié)合Imaje J 圖像處理軟件分析Masson 染色圖片，計(jì)算出膠原纖維容積分?jǐn)?shù)（Collagen volume fraction,CVF），即在同一視野中，染成藍(lán)色的膠原纖維面積與組織總面積的比值，了解膠原纖維在組織中的沉積情況[7]。投喂蠶豆是普通草魚變化到脆肉鯇的主要條件，但蠶豆脆化的形成機(jī)理仍沒有定論。脆肉鯇的器官組織、尤其是肌肉組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化。脆肉鯇肌肉組織中膠原纖維數(shù)量和分布及結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的改變是否是“脆化”形成的主要原因？同時(shí)，肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一定的變化，但是肌細(xì)胞類型是否發(fā)生改變呢？基于此，本試驗(yàn)通過Masson 染色方法，研究脆肉鯇器官組織中膠原纖維的數(shù)量和分布情況，以期為草魚肌肉脆化是否是蠶豆誘導(dǎo)肌肉和其他器官組織中膠原纖維顯著增加的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用脆肉鯇體質(zhì)量7.0 kg，普通草魚體質(zhì)量4.5 kg 取自廣東省中山市東升鎮(zhèn)。將活魚解剖，取1.5 cm3的背?。ū出捪虏俊?cè)線上部）及腹?。ū臣?duì)應(yīng)魚體位置的腹部）肌肉樣品，隨后取心臟、肝胰臟、脾臟、前腸、中腸及后腸，用PBS 緩沖液沖洗，吸干表面后置于4%甲醛溶液中固定，用于切片；然后再取背肌測(cè)定質(zhì)構(gòu)特性。

1.2 方法

將染色后的切片置于（100×、400×）倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用Imaje J 圖像處理軟件對(duì)各組織器官的膠原纖維進(jìn)行定位，并隨機(jī)對(duì)3 幅圖像的膠原纖維面積進(jìn)行測(cè)量，取3 幅圖像均值計(jì)算出膠原纖維面積與視野總面積的比值，即為膠原纖維容積分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用Microsoft Excel 2010 軟件和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和獨(dú)立T 檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通草魚和脆肉鯇背部肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差異

普通草魚和脆肉鯇肌肉經(jīng)過Masson 染色后，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色；相同倍數(shù)下，背肌橫切中可見肌纖維聚集成束，周圍包裹大量疏松結(jié)締組織，為不規(guī)則圓形（圖1-A、1-B）。橫切中可看出，膠原纖維主要在肌束膜中形成沉積。相比于普通草魚，脆肉鯇的肌纖維排列雜亂，肌束較粗。在背肌縱切（圖1-C、1-D）中，普通草魚的肌纖維肌束間的間隙較大且寬，而脆肉鯇的肌纖維束排列更緊密。

圖1 普通草魚和脆肉鯇背肌的組織染色（100 ×）Fig.1 Tissue staining of the back muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鯇背肌的膠原纖維染色比普通草魚深、面積更大（圖1）。脆肉鯇背肌橫切面的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的1.27 倍，從縱切面測(cè)量則是普通草魚的1.13 倍，脆肉鯇背肌的膠原纖維含量比普通草魚高（表1）。

表1 普通草魚和脆肉鯇背肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)Tab.1 Volume fraction of collagen fiber in the back muscle of grass carp and crisped grass carp

2.2 普通草魚和脆肉鯇腹部肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差異

普通草魚腹肌的橫切面肌纖維直徑更小，肌束分布松散，肌纖維間隙更大；從腹肌縱切面觀察到，普通草魚的肌束排列緊密且整齊，相比之下，脆肉鯇的肌束增粗，肌束間排列稀疏且不整齊（圖2）。

圖2 普通草魚和脆肉鯇腹肌的組織染色（100 ×）Fig.2 Tissue staining of the abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp (100 ×)

脆肉鯇腹肌的膠原纖維染色比普通草魚深、面積更大。從表2 可知，脆肉鯇腹肌橫切面的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的2.09 倍，從縱切面測(cè)量則是普通草魚的1.11 倍，脆肉鯇腹肌的膠原纖維含量比普通草魚豐富。

表2 普通草魚和脆肉鯇腹肌膠原纖維容積分?jǐn)?shù)Tab.2 Collagen fiber volume fraction of abdominal muscle of grass carp and crisped grass carp

2.3 普通草魚和脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差異

普通草魚（圖3-I）和脆肉鯇（圖3-J）的肝細(xì)胞形態(tài)清晰，近似卵圓形，且細(xì)胞邊界明顯，細(xì)胞核單個(gè)、居中，呈圓形，肝細(xì)胞索不明顯。相同倍數(shù)下，相比于普通草魚，脆肉鯇的門管區(qū)動(dòng)脈、靜脈管壁間隙中有大量被染為藍(lán)色的膠原纖維，竇周隙中散布膠原纖維，部分肝星狀細(xì)胞中有膠原纖維。由表3可知，脆肉鯇肝胰臟的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的1.41 倍。脾臟實(shí)質(zhì)由紅髓和白髓構(gòu)成，二者混合分布，分界不明顯。白髓由較為密集的淋巴細(xì)胞及少量的吞噬細(xì)胞組成。普通草魚脾臟組織切片中血竇較多，由大量血細(xì)胞聚集而成，形態(tài)不規(guī)則，且周圍含Masson 染色染為藍(lán)色的膠原纖維（圖3-K）。在脆肉鯇脾臟組織切片中可見少量聚集成團(tuán)的吞噬細(xì)胞被染為深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量染為紫紅色的顆粒。紅髓區(qū)域由脾索和脾竇構(gòu)成（圖3-L）。脾索在切面上呈索條狀，內(nèi)含有大量被染成藍(lán)色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維，而脾竇位于脾索之間，脾竇竇腔中含有大量被染為紅色的紅細(xì)胞。

表3 普通草魚和脆肉鯇膠原纖維容積分?jǐn)?shù)Tab.3 Volume fraction of collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

圖3 普通草魚和脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟的組織染色（100 ×）Fig.3 Tissue staining of hepatopancreas,spleen and heart of grass carp and crisped grass carp（100 ×）

脆肉鯇脾臟的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的1.89 倍，遠(yuǎn)高于普通草魚（表3）。心肌纖維呈螺旋狀排列，可同時(shí)觀察到心肌的橫切和縱切面（圖3）。從圖3-M和圖3-N 中均可看到各心肌纖維間由結(jié)締組織相連，結(jié)締組織內(nèi)含有膠原纖維。脆肉鯇心臟的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的3.75 倍（表3），二者存在差異。

2.4 普通草魚和脆肉鯇腸道組織顯微結(jié)構(gòu)觀察和膠原纖維容積分?jǐn)?shù)差異

由圖4 可以清楚觀察到普通草魚和脆肉鯇腸道平滑肌的肌纖維和肌間結(jié)締組織分布，前、中及后腸的平滑細(xì)胞間含有大量被染為藍(lán)色的膠原纖維。相同比例視野內(nèi)，普通草魚前腸（圖4-O）的平滑肌細(xì)胞與結(jié)締組織染色分明，脆肉鯇前腸（圖4-P）的平滑肌細(xì)胞間含有大量錯(cuò)綜排列形成致密的束狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維。普通草魚中腸（圖4-Q）平滑肌細(xì)胞間隙的膠原纖維分布為疏松的束狀結(jié)構(gòu)，排列不緊密，而脆肉鯇中腸（圖4-R）的膠原纖維在平滑肌的內(nèi)環(huán)行及外縱行間分布均勻。普通草魚后腸（圖4-S）的膠原纖維明顯較少，平滑肌細(xì)胞間隙較大，外縱行間及內(nèi)環(huán)行間僅較少膠原纖維，而脆肉鯇后腸（圖4-T）的平滑肌細(xì)胞間膠原纖維分布分層，且膠原纖維的分布在外縱行間明顯比內(nèi)環(huán)行間多。

圖4 普通草魚和脆肉鯇前腸、中腸、后腸的組織染色（400 ×）Fig.4 Tissue staining of foregut,midgut and hindgut of common grass carp and crisped grass carp（400 ×）

脆肉鯇前、中和后腸的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)分別是普通草魚的2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍（表4）。脆肉鯇腸道的膠原纖維含量比普通草魚豐富。

表4 普通草魚和脆肉鯇腸道膠原纖維容積分?jǐn)?shù)Tab.4 Volume fraction of intestinal collagen fiber of grass carp and crisped grass carp

與普通草魚相比，脆肉鯇腸道組織中膠原纖維數(shù)量和分布密度非常明顯，這是本研究的重要結(jié)果。這是否是草魚攝食蠶豆之后，蠶豆成分在誘導(dǎo)膠原蛋白合成量增加、膠原纖維數(shù)量顯著增加，并誘導(dǎo)疏松結(jié)締組織顯著增加首先從腸道組織開始？還是誘導(dǎo)肌肉組織變性主要位點(diǎn)就是在腸道組織？本文提供了很有意義的觀察結(jié)果，但還需要系統(tǒng)試驗(yàn)深入研究。

2.5 普通草魚和脆肉鯇肌肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析

由表5 可知，普通草魚和脆肉鯇背肌的質(zhì)構(gòu)參數(shù)有所差異（P＜0.05）。脆肉鯇的硬度和咀嚼性分別比普通草魚高24.63%和22.11%，差異顯著（P＜0.05）。彈性變化不顯著（P＞0.05）。

表5 普通草魚和脆肉鯇肌肉的質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析Tab.5 Analysis of muscle texture parameters of grass carp and crisped grass carp

3 討論

3.1 脆肉鯇肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

Masson 染色切片對(duì)比和測(cè)量發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇背肌、腹肌的膠原纖維含量比普通草魚的膠原纖維含量要豐富；脆肉鯇背肌橫切面的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的1.27 倍；縱切面是普通草魚的1.13倍，脆肉鯇腹肌橫切面的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)是普通草魚的2.09 倍，縱切面是普通草魚的1.11 倍，且膠原纖維大多存在于肌束膜的結(jié)締組織間。脆肉鯇背肌的硬度和咀嚼性顯著高于普通草魚。林婉玲等[8]比較不同肌肉組織的質(zhì)構(gòu)特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇腹部肌肉脆度大于背部，提出引起脆肉鯇肉質(zhì)清爽脆口的因素之一可能是肌束間隔膜組織增多，肌隔膜可能有膠原蛋白等結(jié)締組織的成分。朱志偉等[9]也發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇的肌肉膠原纖維含量極顯著高于普通草魚肌肉膠原纖維含量。陳度煌[10]在研究質(zhì)構(gòu)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇肌肉硬度、咀嚼性和回復(fù)性比普通草魚分布高15.4%、11.5%和9.76%。張曦等[11]研究發(fā)現(xiàn)，提升草魚肌肉間膠原蛋白含量可以改善草魚質(zhì)構(gòu)性能，增強(qiáng)草魚肌肉品質(zhì)。因此，肌肉中膠原纖維含量的增加可能是脆肉鯇肌肉脆化的因素之一。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蠶豆誘導(dǎo)“脆肉鯇”的“肌肉脆性”形成，肌肉組織中膠原纖維數(shù)量顯著增加，且分布狀態(tài)發(fā)生顯著變化；肌肉組織中疏松結(jié)締組織增生；但肌細(xì)胞類型并未發(fā)生改變。這些結(jié)果對(duì)于探討脆肉鯇肌肉脆化機(jī)制有重要意義，即飼喂的蠶豆組成物質(zhì)中，含有誘導(dǎo)魚體器官組織膠原蛋白質(zhì)合成量和膠原纖維數(shù)量增加、疏松結(jié)締組織增生的作用機(jī)制，可能是誘導(dǎo)肌肉“脆化”的重要作用機(jī)制。

3.2 脆肉鯇腸道組織顯微結(jié)構(gòu)觀察

腸道是重要的消化吸收器官，機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育與腸道的組織形態(tài)密不可分。投飼蠶豆會(huì)抑制脆肉鯇前腸的蛋白酶活性[12]，降低脆肉鯇對(duì)飼料的消化利用率，增加了腸道的定向蠕動(dòng)。魚體腸道肌肉層與腸道節(jié)律性蠕動(dòng)有關(guān)，肌層厚度增加有利于強(qiáng)化腸道消吸收功能[13]。而膠原纖維是支撐平滑肌結(jié)構(gòu)的重要因素，與肌纖維間緊密連接，促進(jìn)腸道平滑肌的收縮與蠕動(dòng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與普通草魚腸道組織相比，脆肉鯇腸道疏松結(jié)締組織顯著改變，膠原纖維數(shù)量顯著增加。腸道組織中，膠原纖維的顯著增加是否是蠶豆成分（具體何種成分目前未知）誘導(dǎo)膠原蛋白合成、膠原纖維數(shù)量顯著增加的首發(fā)位點(diǎn)？這個(gè)問題值得深入研究，這也是探討蠶豆成分誘導(dǎo)“脆肉鯇”形成機(jī)制的重要內(nèi)容之一。

3.3 結(jié)論

本文利用Masson 染色方法，觀察了普通草魚和脆肉鯇背部、腹部肌肉和心臟、肝胰臟、脾臟、前腸、中腸、后腸組織中膠原纖維數(shù)量和分布狀態(tài)，顯示出脆肉鯇的這些器官組織中膠原纖維數(shù)量較多、分布區(qū)域面積較大，組織中疏松結(jié)締組織有增生的狀態(tài)，尤其是腸道組織、血管壁周圍的分布結(jié)果較為明顯。本試驗(yàn)中，脆肉鯇背肌橫切面、腹肌橫切面的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)分別是普通草魚的1.27 倍和2.09 倍，從脆肉鯇背肌縱切面、腹肌縱切面測(cè)量則是普通草魚的1.13 倍和1.11 倍，脆肉鯇肝胰臟、脾臟、心臟、前腸、中腸及后腸的膠原纖維容積分?jǐn)?shù)分別是普通草魚的1.41 倍、1.89 倍、3.75 倍、2.16 倍、1.68 倍和2.66 倍。這些結(jié)果提示：草魚肌肉脆化的機(jī)制可以更多地從肌肉、腸道等器官組織中膠原蛋白合成機(jī)制、膠原纖維數(shù)量變化等深入、系統(tǒng)的研究。