劉雪峰，黃天晴，劉恩慧，徐革鋒，史秀蘭，董福霖，李文文，紀(jì)凱，谷偉，潘玉財(cái)，王炳謙

（1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

中國(guó)約有3.067×107hm2的鹽堿水域，主要分布在東北、華北、西北等地區(qū)。在這些水域中，堿度一直是影響魚(yú)類生長(zhǎng)性能的重要因素[1]。高碳酸鹽堿度會(huì)干擾魚(yú)體滲透調(diào)節(jié)和生理穩(wěn)態(tài)，僅有少部分種類的魚(yú)可以正常生存，生物多樣性顯著降低[2,3]。同時(shí)，全球氣候變暖等因素，內(nèi)陸區(qū)域很多湖泊的水質(zhì)鹽堿化不斷加重，可利用的淡水資源在不斷減少，這給水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)發(fā)展帶來(lái)了巨大的沖擊[4]。為了提高對(duì)鹽堿水的利用效率，采用“以漁改堿”的方法，嘗試在中低濃度的堿水中養(yǎng)殖鯉（Cyprinus carpio）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）等一些抗逆性較強(qiáng)的魚(yú)類，但僅限于在堿度小于10 mmol/L的水域[5]。為了能在中高堿度水域養(yǎng)殖魚(yú)類，近幾年，探究了魚(yú)體在適應(yīng)堿脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)、以及耐堿基因的表達(dá)等方面，并努力收集種質(zhì)資源，積極培育耐高堿度的魚(yú)類優(yōu)良品種，以充分利用堿性水域資源，提高物種多樣性[6-9]。

生長(zhǎng)性能是魚(yú)類水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的關(guān)鍵性狀，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子-I（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）和生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）為調(diào)控生長(zhǎng)作用的關(guān)鍵基因[10]。IGF-1 主要在肝臟中表達(dá)，具有加速細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分裂分化以及減緩細(xì)胞衰亡等多種作用[11]；GH 主要在腦垂體前葉中表達(dá)。其表達(dá)水平還可以影響大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus keta）在海水中的滲透壓調(diào)節(jié)[12]。IGF-1的合成依賴于垂體GH 的分泌狀況[11]。沈立等[13,14]在堿度脅迫異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，IGF-1 和GH 表達(dá)量均升高；Shepherd等的實(shí)驗(yàn)也得到相同的結(jié)論。這表明IGF-1/GH 生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，會(huì)影響魚(yú)體在壓力環(huán)境中的生長(zhǎng)性能。除此以外，王卓等[15]的研究表明，長(zhǎng)期的堿度壓力環(huán)境還會(huì)引發(fā)過(guò)量活性氧的氧化損傷。柳飛等發(fā)現(xiàn)，魚(yú)體可通過(guò)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH）等來(lái)清除過(guò)量的活性氧。丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平能體現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，同時(shí)也可反映魚(yú)體損傷情況[16,17]。因此，在對(duì)魚(yú)類慢性脅迫實(shí)驗(yàn)中加入對(duì)IGF-1/GH 表達(dá)和抗氧化酶活性的探究，可能是探究該魚(yú)種抗逆性能較為合適的方法。

烏蘇里白鮭（Coregonus ussuriensis Berg）是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的冷水性魚(yú)類，主要分布于中國(guó)黑龍江流域及俄羅斯西伯利亞、薩哈林等水域[18]。近幾十年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、生存環(huán)境惡化以及水利水電工程建設(shè)，烏蘇里白鮭的生存空間受到持續(xù)擠壓，其資源量呈顯著下降，目前已被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)魚(yú)類》名錄[19]。本研究通過(guò)分析烏蘇里白鮭慢性堿脅迫的生長(zhǎng)性能和抗氧化酶活性變化，及生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量的變化，以期為探究烏蘇里白鮭在中低鹽堿環(huán)境中的適應(yīng)能力奠定基礎(chǔ)，也為烏蘇里白鮭生境的擴(kuò)大、保護(hù)增產(chǎn)以及提高堿水域中物種多樣性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用烏蘇里白鮭來(lái)自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚(yú)類試驗(yàn)站。正式實(shí)驗(yàn)前在循環(huán)控溫玻璃水族箱中淡水暫養(yǎng)兩周。水溫18 ℃，水中溶氧量8.0 mg/L，氨氮含量小于0.2 mg/L，pH 為7.5±0.2，亞硝酸鹽含量＜0.001 mg/L。選擇150 尾初始平均體質(zhì)量（60.43±2.45）g，平均體長(zhǎng)（17.19±1.50）cm的健康烏蘇里白鮭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)除了碳酸鹽堿度不同外，溫度、溶氧量和pH 等水質(zhì)條件均保持不變。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)在180 cm×60 cm×47 cm 的循環(huán)控溫水族箱中進(jìn)行，水中碳酸氫鈉堿度分別為0 mmol/L（對(duì)照組）、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L 和30 mmol/L（堿度組），每個(gè)缸分成三個(gè)平行組（每個(gè)平行n=10），每個(gè)堿度組30 尾魚(yú)，逐步升堿，最后一天各組均達(dá)到預(yù)計(jì)堿度后投喂。pH 控制在8.5 左右[2]，生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)42 d。每日上午9：00 和下午4：00 飽時(shí)投喂兩次，投喂量為體質(zhì)量的2%～4%。撈出殘餌曬干稱重，每日記錄攝食量，根據(jù)攝入量調(diào)整日投喂量。每3 d 換水1/3，換水前后測(cè)定堿度，保持堿度不變。

每7 d 測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)和體質(zhì)量，精確至小數(shù)點(diǎn)后兩位，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。最后一次采樣前魚(yú)禁食24 h，每個(gè)平行組取3 尾，每個(gè)堿度組取9 尾，用MS-222（200 mg/L）麻醉、測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)和體質(zhì)量，解剖取腦和肝臟樣品迅速放在液氮中，-80 ℃儲(chǔ)存。

用下列公式計(jì)算不同碳酸鹽堿度下脅迫6 周的烏蘇里白鮭的生長(zhǎng)性能：平均日增重（ADG）、增重率（WGR）、飼料系數(shù)（FCR），及特定生長(zhǎng)率（SGR）。

其中，W1和W2分別為每組魚(yú)的平均初始體質(zhì)量和最終體質(zhì)量（g）；T 為實(shí)驗(yàn)時(shí)間（d）；Wf為實(shí)驗(yàn)期間的平均每尾魚(yú)的食物攝入量（g）。

酶活力測(cè)定：每組隨機(jī)取3 尾魚(yú)的肝組織用冰冷生理鹽水沖洗后稱量0.1 g，加入9 倍體積的冷生理鹽水（7.5 g/kg 氯化鈉，pH=7.0），高通量研磨儀制成勻漿。在4 ℃、3 000 r/min 下離心10 min，取上清測(cè)定抗氧化酶GSH、CAT 和SOD 活性及MDA 濃度，最終取三次重復(fù)測(cè)定值的平均值，具體步驟參照試南京建成生物科技有限公司劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

總RNA 提取、cDNA 合成、熒光定量PCR：每個(gè)堿度組取三尾魚(yú)的腦和肝臟組織各0.4 g。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用RNA 試劑盒（美國(guó)康寧，AP-MN-MS-RNA-250）提取，再用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度（比率260/280 和260/230）確定RNA 的質(zhì)量；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。按說(shuō)明書(shū)將合格的RNA通過(guò)TaKaRa 公司的PrimeScript RT 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入500 ng 的Total RNA 和2 μL 5×Prime-Script RT Master Mix 混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，1 min。用Prime Premier5.0 設(shè)計(jì)引物，IGF-1、GH 引物序列如表1 所示。用β-actin作為內(nèi)參，RT-qPCR 反應(yīng)體系為2×S6 Universal SYBR qPCR mix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR 反應(yīng)條件如下：95 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)（95 ℃，5 s；60 ℃，34 s），最后95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。熒光定量PCR 反應(yīng)結(jié)果使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 qRT-PCR 所用的引物及序列Tab.1 Primers and sequences for quantitative RT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

圖中所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行單向方差分析；使用鄧肯檢驗(yàn)的多重比較來(lái)確定組間顯著差異，P＜0.05 時(shí)表示差異顯著；使用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸氫鈉堿度脅迫對(duì)烏蘇里白鮭存活和生長(zhǎng)的影響

5 mmol/L和10 mmol/L碳酸氫鈉堿度下，烏蘇里白鮭的終末體質(zhì)量分別比對(duì)照組高5.4%（P＜0.05）和10.3%（P＜0.05），而20 mmol/L、30 mmol/L兩組僅為對(duì)照組的91.5%（P＜0.05）和88.9%（P＜0.05）（圖1）。各堿度組體質(zhì)量增長(zhǎng)速度由高到低依次為：10 mmol/L、5 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L。各組烏蘇里白鮭的生長(zhǎng)性能見(jiàn)表2。5 mmol/L、10 mmol/L堿度組烏蘇里白鮭攝食總量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），20 mmol/L、30 mmol/L組中攝食總量與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。淡水對(duì)照組幼魚(yú)的增長(zhǎng)速度介于5 mmol/L和20 mmol/L組之間，10 mmol/L堿度組中ADG、SGR 和WGR 最高（P＜0.05）。當(dāng)堿度大于20 mmol/L時(shí)，生長(zhǎng)性能開(kāi)始降低，30 mmol/L組最低（P＜0.05），而飼料系數(shù)最高，是對(duì)照組的1.23 倍，20 mmol/L組的飼轉(zhuǎn)率與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同堿度的NaHCO3 對(duì)烏蘇里白鮭體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different NaHCO3 alkalinities on body weight of juvenile Usscuri whitefish C.ussuriensis

表2 不同堿度處理組烏蘇里白鮭生長(zhǎng)性能及飼料系數(shù)Tab.2 Growth performance and feed utilization of Usscuri whitefish C.ussuriensis exposed to different alkalinity levels

2.2 碳酸氫鈉堿度脅迫對(duì)烏蘇里白鮭抗氧化酶與丙二醛活性的影響

5 mmol/L組烏蘇里白鮭肝臟中SOD、GSH 和CAT活性與MDA 活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；10 mmol/L 組中SOD 酶活性比對(duì)照組高16%（P＜0.05），CAT、GSH、MDA 三種酶與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；20 mmol/L組中SOD、CAT、MDA 的酶活性顯著升高（P＜0.05），30 mmol/L組中SOD、CAT酶活性和MDA 含量達(dá)峰值（P＜0.05）。GSH 活性最高的處理組為20 mmol/L，30 mmol/L次之（P＜0.05）（圖2）。

2.3 碳酸氫鈉堿度脅迫對(duì)烏蘇里白鮭IGF-1 和GH 基因表達(dá)的影響

5 mmol/L組烏蘇里白鮭肝組織中IGF-1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），垂體中的GH 表達(dá)水平是對(duì)照組的2.26 倍（P＜0.05）；在10 mmol/L組中，IGF-1 和GH 的表達(dá)量達(dá)最大值（P＜0.05）。從20 mmol/L組起，表達(dá)量隨堿度增加而降低，20 mmol/L組中IGF-1 的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的41%（P＜0.05），GH基因表達(dá)量則降低至對(duì)照組的50%（P＜0.05）。30 mmol/L組兩種基因的表達(dá)量最低（P＜0.05，圖3）。

圖3 不同NaHCO3 堿度組烏蘇里白鮭肝臟中IGF-1 和垂體中GH 基因表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes in IGF-1 expression in the liver and GH expression in the pituitary of Usscuri whitefish C.ussuriensis exposed to different levels of NaHCO3 alkalinity

3 討論

堿度顯著影響魚(yú)類的生長(zhǎng)、生理過(guò)程和相關(guān)基因的表達(dá)[20,21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暴露于低NaHCO3堿度（5 mmol/L、10 mmol/L）中的烏蘇里白鮭生長(zhǎng)性能（ADG、SGR、FCR、WGR）顯著高于對(duì)照組和高NaHCO3堿度（20 mmol/L、30 mmol/L）組。在30 d 的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，卡拉白魚(yú)（Alburnus chalcoides）在7 mmol/L 中的增重率和增長(zhǎng)率最高[22]；4 mmol/L的堿度可以提高異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的生長(zhǎng)率[23]。根據(jù)前期池塘養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)，烏蘇里白鮭在體質(zhì)量達(dá)200 g 之前，生長(zhǎng)速度受溫度影響較大，北方池塘中水溫變化幅度大，生長(zhǎng)速率較低，6 周的生長(zhǎng)速率僅為40.0%左右。本研究中，水溫為烏蘇里白鮭最適生長(zhǎng)溫度18 ℃，各組魚(yú)的生長(zhǎng)速率顯著高于池塘。20 mmol/L、30 mmol/L兩組攝食總量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，生長(zhǎng)性能較低的原因并非高堿度使烏蘇里白鮭食欲降低所致，可能是從飼料中吸收的能量轉(zhuǎn)化為體質(zhì)量的部分減少。伍德等將生長(zhǎng)性能下降歸因于滲透壓調(diào)節(jié)對(duì)能量的要求，整個(gè)生長(zhǎng)階段需要大量能量來(lái)適應(yīng)壓力條件[24,25]。為適應(yīng)高滲環(huán)境，魚(yú)類需要進(jìn)行大量生理活動(dòng)，這會(huì)影響新陳代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)性能降低甚至死亡[26]?？傊?，堿度對(duì)烏蘇里白鮭的影響具有劑量效應(yīng)，堿度過(guò)高會(huì)抑制其生長(zhǎng)性能。

活性氧（ROS）是氧代謝的副產(chǎn)物，壓力條件會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體活性氧急劇升高[26]。過(guò)量的ROS 能氧化損傷細(xì)胞和組織，生物激活抗氧化防御系統(tǒng)，以防止過(guò)量的活性氧對(duì)身體的氧化損傷[27,28]。GSH、SOD 和CAT 等抗氧化酶可以去除活性氧，增強(qiáng)機(jī)體防御能力[30]。在急性碳酸鹽堿度脅迫下，白蝦（Echinocereus bonkerae）的抗氧化酶系統(tǒng)可以被激活以適應(yīng)外部環(huán)境[31]；在趙巖等的堿度脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus）的抗氧化系統(tǒng)受損時(shí)，脅迫后組織細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生氧化損傷[27]。在本研究中，20 mmol/L和30 mmol/L組烏蘇里白鮭肝組織三種抗氧化酶均顯著上升（P＜0.05），說(shuō)明高堿性時(shí)機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)會(huì)及時(shí)消除過(guò)量活性氧，保護(hù)機(jī)體不受氧化損傷。肝組織中三種抗氧化酶的活性變化趨近相似，這說(shuō)明在烏蘇里白鮭體內(nèi)抗氧化酶在應(yīng)對(duì)堿度脅迫時(shí)相互協(xié)調(diào)共同作用，這與堿度脅迫下的中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）抗氧化酶活性研究結(jié)果相似[32]。而5 mmol/L、10 mmol/L兩組抗氧化酶活性與對(duì)照無(wú)差異，均維持在一個(gè)正常范圍內(nèi)，說(shuō)明烏蘇里白鮭能適應(yīng)中低堿度的水中產(chǎn)生的少量活性氧，這與張琴星等的研究結(jié)論一致[33]。

活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA含量升高[34]。范澤等在碳酸鹽堿脅迫松浦鯉（Cyprinus carpio Songpu）的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高堿度組中鯉肝組織中MDA 含量顯著升高[34]。本研究中，30 mmol/L堿度組烏蘇里白鮭肝組織中MDA 含量達(dá)到峰值，說(shuō)明在該堿度下，烏蘇里白鮭肝組織中抗氧化酶活力升高不足以緩解該魚(yú)體內(nèi)的氧化損傷。5 mmol/L、10 mmol/L堿度組下，該魚(yú)肝臟中未見(jiàn)MDA活性升高，這表明低堿度不會(huì)引起魚(yú)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象。

IGF-1/GH 生長(zhǎng)軸基因在不同環(huán)境中表達(dá)量差異可能是生長(zhǎng)相關(guān)的重要生物標(biāo)志物[35]。從垂體釋放的GH 通過(guò)門(mén)靜脈血液循環(huán)并與肝臟GH 受體結(jié)合，刺激IGF-1 的合成和釋放，最后IGF-1 以負(fù)反饋?zhàn)饔糜诖贵w[36]。盡管越來(lái)越多的研究支持IGF-1/GH系統(tǒng)在調(diào)節(jié)魚(yú)類生長(zhǎng)中的作用，但對(duì)其在堿水環(huán)境中的表達(dá)水平研究十分有限。IGF-1/GH 系統(tǒng)在滲透壓變化過(guò)程中維持魚(yú)類生理平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[37]。畢保良等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）在半咸水中GH 表達(dá)水平最高[38]；沈立等在6 d 的堿度脅迫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽IGF-1 和GH激素水平均顯著高于對(duì)照組[20]，這與本研究的結(jié)果相一致。在本研究中，5 mmol/L和10 mmol/L組中烏蘇里白鮭的IGF-1/GH 兩種基因均顯著上調(diào)（P＜0.05）。這表明IGF-1/GH 生長(zhǎng)軸可以通過(guò)參與烏蘇里白鮭的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制幫助其適應(yīng)中低堿水環(huán)境而表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)性能。

當(dāng)魚(yú)類處于高滲環(huán)境中時(shí)，會(huì)影響GH 水平和食物攝入及生長(zhǎng)[38]。在本研究中，相比于對(duì)照組，20 mmol/L和30 mmol/L組中，GH 的表達(dá)量和生長(zhǎng)性能均顯著降低，可能是生長(zhǎng)因子在較高堿度下的合成受到抑制，這與迪恩等[39]的研究結(jié)論相同。除了加速魚(yú)體生長(zhǎng)之外，IGF-1 的表達(dá)量還可以影響鮭適應(yīng)海水環(huán)境的能力[40]，在20 mmol/L、30 mmol/L兩組烏蘇里白鮭中觀察到IGF-1 表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），這說(shuō)明堿度過(guò)高，烏蘇里白鮭肝組織中IGF-1 表達(dá)受到抑制，持續(xù)維持在較低水平，影響魚(yú)生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，在較高的堿度中，烏蘇里白鮭IGF-1/GH 系統(tǒng)受到抑制，影響其生長(zhǎng)，這為長(zhǎng)期堿度生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)論提供了參考。

綜上所述，較高的堿度環(huán)境使烏蘇里白鮭增加肝臟中GSH、SOD 和CAT 三種抗氧化酶活性來(lái)消除細(xì)胞中的活性氧，并通過(guò)抑制其垂體中GH 的表達(dá)以及肝臟中IGF-1 的表達(dá)而降低生長(zhǎng)性能。烏蘇里白鮭在10 mmol/L的低堿度環(huán)境中生長(zhǎng)較好，與對(duì)照組相比具有更高的增重率及更低的飼料系數(shù)。盡管在30 mmol/L堿度環(huán)境中MDA 含量顯著升高，不利于烏蘇里白鮭生長(zhǎng)，但并不影響其生存。本研究為探究烏蘇里白鮭適應(yīng)堿性環(huán)境的生理機(jī)制提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，有助于制定在堿度環(huán)境中養(yǎng)殖的策略，對(duì)這一物種資源量的恢復(fù)以及中低堿度水域開(kāi)發(fā)利用具有參考價(jià)值。