陳彩萍，章潮軍，王小平，徐作武，徐慧婷

（1.浙江昌海制藥有限公司，浙江 紹興 312000；2.浙江可明生物醫(yī)藥有限公司，浙江 紹興 312000；3.浙江紹興文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000；4.脂溶性維生素浙江省工程研究中心，浙江 紹興 312000）

含氮雜環(huán)化合物種類繁多，數(shù)量龐大，在自然界中廣泛分布，許多天然含氮雜環(huán)化合物在動(dòng)植物體內(nèi)起著重要的生理作用[1-3]。5-氨基咪唑是一類具有多種生物活性的雜環(huán)類化合物[4-9]，廣泛用于抗血小板、抗菌、抗炎、抗癌等藥物的研發(fā)，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)它還是合成藥物活性分子和天然生物活性分子的重要合成砌塊，如被用于5-氨基咪唑核苷酸的生物合成，咪唑啉殺蟲(chóng)劑的合成，促性腺激素釋放激素受體拮抗劑的合成等。5-氨基咪唑類化合物在藥理學(xué)方面表現(xiàn)出廣泛的生物活性[10-11]，如抗癌活性，在脂肪細(xì)胞中通過(guò)WNT/B-連環(huán)蛋白通路抑制脂肪生成，通過(guò)AMP-活化的蛋白激酶依賴路徑誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450 4F2的表達(dá)和在骨骼肌中增加去乙?；傅谋磉_(dá)。

5-氨基咪唑在化學(xué)和生物方面具有相當(dāng)大的功能性，但是，傳統(tǒng)的合成5-氨基咪唑的方法[12-13]都存在著或多或少的缺陷，大都存在著原子經(jīng)濟(jì)性和步驟經(jīng)濟(jì)性差、產(chǎn)率低、反應(yīng)條件相對(duì)苛刻以及副產(chǎn)物多、后處理困難等不足，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，因此開(kāi)發(fā)一種新的綠色、高效的合成5-氨基咪唑的方法就顯得尤為重要。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的5-氨基咪唑類化合物的合成方法主要有以下5 種：①硝基還原或者疊氮基還原法；②1-氨基-1，2，4-三氮唑法；③微波合成法；④原乙（甲）酸三乙酸酯法；⑤異腈法。

利用還原法[14-15]合成5-氨基咪唑的主要原料是5-硝基咪唑，或者5-疊氮基咪唑，通過(guò)使用Pd/H2催化劑對(duì)反應(yīng)進(jìn)行催化還原，從而得到所需要的5-氨基咪唑，反應(yīng)方程式如圖1所示。由于所使用的原料為5-硝基咪唑或5-疊氮基咪唑，原料來(lái)源不便，且使用Pd/H2催化，成本較高，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，而且H2易燃，在反應(yīng)過(guò)程中極易引發(fā)爆炸，存在安全隱患。此外，使用5-疊氮基咪唑還原法制備5-氨基咪唑時(shí)，產(chǎn)率較低，僅有71%。

圖1 還原法合成5-氨基咪唑的反應(yīng)式

Donskaya O V 課題組[16]利用該方法合成5-氨基咪唑的主要原料是4-硝基咪唑和1-氨基-1，2，4-三氮唑，使用強(qiáng)堿叔丁醇鉀為催化劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)方程式如圖2所示。雖然該方法也可以成功合成5-氨基咪唑，且原料相對(duì)而言較為廉價(jià)，反應(yīng)過(guò)程也比較安全，但是還是存在一定的問(wèn)題，如產(chǎn)率太低，僅有39%，因此也不適于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。

圖2 1-氨基-1，2，4-三氮唑法合成5-氨基咪唑的反應(yīng)式

Soh C.H.等[17]首先使用腈類化合物和原硫酸二乙酯在微波條件下80℃高收率合成硫代酰胺1，接下來(lái)在氯仿中80℃與芐溴反應(yīng)，生成硫代亞胺類化合物2，然后再與氨基乙腈類化合物反應(yīng)生成5-氨基咪唑化合物3，反應(yīng)方程式如圖3 所示。該方法與傳統(tǒng)的合成方法相比，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程僅需25 min。但是由于該方法整個(gè)過(guò)程是在微波條件下進(jìn)行，存在安全隱患。

圖3 微波法合成5-氨基咪唑的反應(yīng)式

Ray S.與Das A.等[18]把2-氨基-2-氰基乙酰胺在干燥蒸餾的乙腈中加入原甲酸三乙酯，加熱回流一段時(shí)間后冷卻到室溫時(shí)，加入伯胺進(jìn)行反應(yīng)，在容器表面會(huì)產(chǎn)生沉淀，將此產(chǎn)物用乙腈洗滌后得到粗產(chǎn)物，該法僅有一步實(shí)驗(yàn)流程，較為快捷，但是整個(gè)反應(yīng)過(guò)程需要長(zhǎng)時(shí)間的加熱回流，產(chǎn)物沉淀之后，也需要用乙腈多次沖洗，后續(xù)操作過(guò)于麻煩，反應(yīng)方程式如圖4所示。

圖4 原乙（甲）酸三乙酸酯法合成5-氨基咪唑的反應(yīng)式

John T.Hunt 等[19]使用異硫脲1 和異氰乙酸乙酯鉀鹽2 在六甲基磷酰三胺中混合，以氯化亞銅為催化劑。在室溫下反應(yīng)幾小時(shí)得到所要產(chǎn)物，但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，總是會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)多碳二亞胺的中間產(chǎn)物，比如，反應(yīng)物2在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)后所得的產(chǎn)物產(chǎn)率只有30%，而且反應(yīng)生成兩種產(chǎn)物，選擇性較差。因此，此法雖然能在常溫下，利用一個(gè)合成步驟合成產(chǎn)物，但是產(chǎn)率極低，選擇性較差，反應(yīng)方程式如圖5所示。

圖5 異氰法合成5-氨基咪唑的反應(yīng)式

本文提供一種一鍋法制備5-氨基咪唑化合物的方法，合成系列化合物并通過(guò)MTT 比色法對(duì)其生物活性進(jìn)行檢測(cè)。合成路線如圖6：以芳基硫脲和異氰為起始原料，DUB 為催化劑，制備5-氨基咪唑化合物，并對(duì)其進(jìn)行表征分析。

圖6 5-氨基咪唑化合物的制備路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

核磁共振儀，AVANCE DMX ⅡⅠ400M，TMS內(nèi)標(biāo)，Bruker 公司；熔點(diǎn)儀，MP30，梅特勒；高分辨質(zhì)譜儀（HRMS），島津。

1.2 試劑（表1）

表1 試劑

1.3 5-氨基咪唑化合物的制備

于25 mL 的圓底燒瓶中加入磁力攪拌子，芳基硫脲（1.2 mmol），異腈（1.0 mmol）和DMF（5 mL），隨后向上述體系中緩慢加入DBU（2.0 mmol），于室溫下攪拌反應(yīng)24 h，點(diǎn)板跟蹤直至反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，往反應(yīng)體系中加入飽和食鹽水溶液和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取有機(jī)層，反復(fù)萃取3次，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得到粗品，再經(jīng)柱色譜分離純化（乙酸乙酯∶石油醚=1∶10）得目標(biāo)5-氨基咪唑衍生物，詳見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)物及其收率

產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為：

化合物1表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為白色固體，收率65%，熔點(diǎn)198.6℃～200.9℃。1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.87（d，J = 8.5 Hz，2H），7.28-7.27（m，2H），7.14-7.09（m，2H），7.01-6.95（m，2H），6.92-6.91（m，1H），6.81-6.75（m，2H），6.66（s，1H），6.42（d，J=7.0 Hz，1H），2.40（s，3H），2.13（s，3H），2.10（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）: δ 143.94，140.12，139.16，138.92，134.85，134.74，133.27，130.99，130.44，129.77，129.51，127.53，127.25，126.58，126.12，125.61，123.62，119.95，21.62，17.78，17.57。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C24H24N3O2S [M+H]+:418.158 4，found: 418.158 5。

化合物2表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為淺黃色固體，收率60%，熔點(diǎn)200.8℃～203.3℃。

1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.81（d，J = 8.5 Hz，2H），7.48（s，1H），7.23（d，J=8.0 Hz，2H），7.17-7.13（m，3H），6.91-7.86（m，2H），6.61（d，J = 7.5 Hz，1H），6.38（d，J=7.5 Hz，1H），6.34（s，1H），2.39（s，3H），2.25（s，3H），2.09（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3） δ 144.06，142.02，139.72，138.81，138.75，136.58， 134.82， 134.77， 129.80， 129.51， 129.31，128.82， 127.66， 127.59， 124.94， 123.06， 121.29，118.75，115.11，21.71，21.30，21.29。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C24H24N3O2S [M+H]+:418.158 4，found: 418.158 0。

化合物3表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為黃色固體，收率69%，熔點(diǎn)195.6℃～197.6℃。

1HNMR（500 MHz，CDCl3）: δ 7.85（d，J = 8.5 Hz，2H），7.72（s，1H），7.55（d，J=8.5 Hz，2H），7.53（s，1H），7.34-7.32（m，2H），6.93-6.88（m，3H），6.70（s，1H），6.69-6.65（m，1H），6.45（d，J = 8.0 Hz，1H），2.38（s，3H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 144.90，140.11，138.76，135.31，134.98，133.69，133.06，132.58，131.04，129.85，129.38，128.35，128.21，127.99，123.66，120.54，117.52，113.48，21.66。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C22H17Br2N3O2S [M+H]+:544.940 8，found: 544.940 3。

化合物4 表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為淺黃色固體，收率79%，熔點(diǎn)145.0℃～147.6℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ: 7.41-7.37（m，3H），7.28-7.26（m，2H），7.21（d，J=8.5 Hz，2H），7.11（d，J = 8.0 Hz，2H），6.98-6.78（m，2H），6.07（s，1H），4.43-4.38（m，2H），1.43-1.40（m，3H）;13C NMR（CDCl3，125 MHz） δ: 175.36，150.70，144.22，142.62，138.59，136.09，129.32，129.00，127.59，124.27，122.09，117.62，63.24，14.75。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C18H17N3O2[M+H]+:307.132 1，found: 307.131 5。

化合物5 表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為白色固體，收率73%，熔點(diǎn)148.0℃～149.1℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ:7.41（s，1H），7.14（d，J=8.5 Hz，2H），7.06（d，J=8.5 Hz，2H），6.80（d，J=8.0 Hz，2H），6.69（d，J = 8.0 Hz，2H），6.0（s，1H），4.39（q，J=8.0 Hz，2H），2.37（s，3H），2.26（s，3H），1.39（q，J=8.0 Hz，3H）.13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ:174.86，150.12，143.88，139.93，138.83，136.92，132.13，131.47，129.52，127.56，124.12，117.82，63.55，29.82，29.27，14.50。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C20H21N3O2[M+H]+:335.163 4，found: 335.163 8。

化合物6 表征數(shù)據(jù)：產(chǎn)品為黃色固體，收率77%，熔點(diǎn)123.8℃～125.0℃。

1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ:7.46（s，1H），7.45（d，J=8.5 Hz，2H），7.22（d，J=8.0 Hz，2H），7.18（d，J=9.0 Hz，2H），7.15（d，J = 8.5 Hz，2H），6.35（s，1H），4.37-4.26（m，2H），1.39-1.36（s，3H）.13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ:175.05，144.60，141.95，138.00，134.97，132.03，129.88，127.68，125.81，123.05，118.44，61.56，14.51。

HRMS（ESI）: m/z calcd for C18H15Br2N3O2[M+H]+:462.953 1，found: 462.953 5。

1.4 MTT比色法測(cè)定化合物的抗細(xì)胞增殖活性

將化合物1～6 用DMSO 溶解后稀釋，將細(xì)胞株SW620（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、MKN45（肺癌細(xì)胞）、MKN-28（胃癌細(xì)胞）、T47D（人乳腺癌細(xì)胞）、3AO（卵巢癌細(xì)胞）在96 孔板上種入4 000 個(gè)/200 μL/孔，每孔加入化合物2 μL，終濃度分別為100 μM、50 μM、20 μM、10 μM、5 μM、2.5 μM，在細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中孵育72 h，以DMSO（1%）為空白對(duì)照。72 h 后加入終濃度為0.25 mg/mL 的MTT，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，之后吸干溶劑，每孔加入100 μL的DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度值（OD 值），計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率以及被測(cè)樣品的IC50值，公式如下：

抑制率=[1-（測(cè)試樣品的OD 值-空白OD 值）/（陰性對(duì)照的OD值-空白OD值）]*100

lg IC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，其中，Xm=lg[最大劑量]，I=lg[最大劑量/相臨計(jì)量]；P 為陽(yáng)性反應(yīng)率之和，Pm為最大陽(yáng)性反應(yīng)率，Pn為最小陽(yáng)性反應(yīng)率，結(jié)果如表3所示。

表3 化合物（1～5）對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的IC50

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該系列化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞活性有較強(qiáng)的抑制功能，特別是化合物1 對(duì)SW620（人結(jié)腸癌細(xì)胞）、MKN45（肺癌細(xì)胞）、MKN-28（胃癌細(xì)胞）均有明顯的效果。

2 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)的一鍋法制備5-氨基咪唑化合物的合成路線有以下優(yōu)勢(shì)：①原料簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；②實(shí)驗(yàn)步驟少，反應(yīng)操作方便，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)為一鍋煮的方法，減少了中間體的分離純化步驟，降低了成本；③收率高，具有推廣應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，5-氨基咪唑類化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文通過(guò)MTT比色法測(cè)定了化合物的抗細(xì)胞增殖活性，為其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供了思路。