鐘琳

（湖北大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430061）

細(xì)胞是生命體的基本結(jié)構(gòu)和功能單元，許多生命活動(dòng)都發(fā)生在單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平上。在眾多納米尺度的研究技術(shù)中，基于納米電極的電化學(xué)方法具有高靈敏度、高時(shí)空分辨率和強(qiáng)大的定量能力等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞研究領(lǐng)域中。例如，納米電極具有極小的尺寸，在探索亞細(xì)胞和細(xì)胞生物過(guò)程（如細(xì)胞內(nèi)事件和細(xì)胞間通訊過(guò)程）的同時(shí)，能夠很好地維持細(xì)胞活力。此外，通過(guò)將納米電極與其他平臺(tái)（如掃描電化學(xué)顯微鏡、原子力顯微鏡和掃描離子電導(dǎo)顯微鏡）進(jìn)一步結(jié)合，還可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)獲取細(xì)胞的電化學(xué)信號(hào)和形貌信息[1-3]。盡管基于納米電極的電化學(xué)方法已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但納米電極的發(fā)展仍然遇到一些不可避免的阻礙，如制備過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)、技術(shù)難度高以及機(jī)械穩(wěn)定性較差等。

銀納米線（Ag NWs）是一種近期發(fā)展迅速的一維納米材料，其導(dǎo)電性和機(jī)械性能良好，因此可作為基底材料用于制備納米電極[4-5]。目前已有多種合成Ag NWs的方法，包括模板法、微波加熱法、紫外線照射法和多元醇法等。與其他合成方法相比，多元醇法具有工藝簡(jiǎn)單、尺寸均勻、分散性好以及結(jié)構(gòu)可控等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。因此，通過(guò)控制反應(yīng)條件或者引入控制性物質(zhì)（如不銹鋼片、二價(jià)或三價(jià)鐵鹽、一價(jià)或二價(jià)銅鹽、硫離子和氯離子等），可以大規(guī)模地合成具有不同長(zhǎng)徑比的Ag NWs。

本文首先采用多元醇法合成Ag NWs，優(yōu)化其反應(yīng)條件，隨后在碳纖維微電極表面靠取單根Ag NW 以制備單根銀納米線電極（Ag NWE），電極制備過(guò)程如圖1所示。最后，對(duì)制備的Ag NWE 進(jìn)行形貌、電化學(xué)和單細(xì)胞插入表征，證明其具有合適的一維尺寸、良好的電化學(xué)性能和機(jī)械性能，這不僅促進(jìn)了納米電極的發(fā)展，還為單細(xì)胞研究提供了一種極具潛力的納米工具。

圖1 銀納米線電極（Ag NWE）制備過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation process of silver nanowire electrode（Ag NWE）

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

硝酸銀（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=1 300 000），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙二醇（EG）、二水合氯化銅（CuCl2·2H2O）、乙醇（C2H6O）、鐵氰化鉀［K3Fe（CN）6］、氯化鉀（KCl），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O），北京伊諾凱科技有限公司；導(dǎo)電銀膠AS6880，浙江善仁新材料科技有限公司；聚二甲基硅氧烷（PDMS），道康寧有限公司；玻璃毛細(xì)管，內(nèi)徑Φ 0.5 mm，成都華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；高分化的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12），賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 分析測(cè)試儀器

Sigma 500 掃描電子顯微鏡，德國(guó)蔡司；MF-830 拋光儀，日本成茂；MP-225 電動(dòng)微操縱器，美國(guó)Sutter；Ti2-U 倒置熒光顯微鏡，日本尼康；CHI 660E 電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司。

1.3 合成與優(yōu)化銀納米線

采用改進(jìn)的多元醇法[8]合成Ag NWs。首先將5 mL 0.05 mol/L AgNO3/EG 溶液和5 mL 0.1 mol/L PVP/EG 溶液加入到聚四氟乙烯內(nèi)膽中混合，在80℃下邊加熱邊攪拌，然后將10 μL 0.025 mol/L FeCl3溶液加入至上述混合溶液中，在160℃下孵育10 h。最后，用去離子水清洗沉淀物5 次以去除PVP 殘留物，12 000 r/min 離心5 min后將產(chǎn)物分散在乙醇中。

為了探究AgNO3與PVP之間的摩爾比對(duì)Ag NWs形貌尺寸的影響，將上述過(guò)程中AgNO3和PVP的摩爾比從1∶2 提高至1∶6。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[9]所述，還可以通過(guò)改變金屬離子的種類來(lái)合成Ag NWs，以探究其對(duì)Ag NWs形貌尺寸的影響。合成過(guò)程如下：首先，將圓底燒瓶中20 mL 的EG 溶液在160℃的油浴條件下預(yù)熱5 min，然后向溶液中添加1.5 mL 8 mmol/L 的CuCl2溶液，10 min后向溶液中加入10 mL 0.12 mol/L的AgNO3和0.36 mol/L PVP的混合物。反應(yīng)25 min后，沉淀以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，并用丙酮和乙醇洗滌。最后，將Ag NWs分散到乙醇溶液中，備用。

1.4 制備銀納米線電極

Ag NWE 的制備過(guò)程如圖1 所示。首先，采用火焰蝕刻的方法[10]制備了長(zhǎng)度約為10 ～20 μm、尖端直徑約為1 μm 的碳纖維電極（CFE）。然后，在拋光儀的輔助下，將導(dǎo)電銀膠薄薄地涂覆在暴露的碳纖維上。隨后，將CFE的尖端放入Ag NWs分散液中靠取數(shù)次，在拋光儀下觀察是否成功蘸取單根Ag NW，反復(fù)蘸取直至成功為止?？咳〕晒螅瑢g NW 與碳纖維的連接處在拋光儀的鉑絲上稍加熱，然后將其置于60℃烘箱中干燥，以加固單根Ag NW 與碳纖維之間的連接。然后將干燥后的電極通過(guò)橡皮泥水平固定在拋光儀的橫向玻璃夾上，拋光儀的豎向玻璃夾上豎直放置裝有PDMS的玻璃毛細(xì)管（尖端直徑約為2 μm），用硅膠毛細(xì)管和注射器將玻璃毛細(xì)管中的PDMS壓出掛在毛細(xì)管尖端，并將PDMS修飾在碳纖維上以實(shí)現(xiàn)絕緣，使電極僅暴露出Ag NW 作為電極活性區(qū)域。最后，將其放置于60℃烘箱中干燥即完成電極的制備。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與單細(xì)胞插入實(shí)驗(yàn)

PC12 細(xì)胞在RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco，補(bǔ)充10%胎牛血清和2% 100 U/mL 青霉素-鏈霉素混合溶液）中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持在37℃和5% CO2條件下。當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，按傳代比例為1∶4進(jìn)行傳代（培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞一般3～4天傳代一次，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基）。

在進(jìn)行單細(xì)胞插入實(shí)驗(yàn)之前，PC12 細(xì)胞在35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2～3 天，并且培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基額外添加了50 ng/mL 的NGF。隨后，用PBS 溶液取代培養(yǎng)基，將準(zhǔn)備的細(xì)胞培養(yǎng)皿用于單細(xì)胞插入實(shí)驗(yàn)。具體過(guò)程如下：將Ag NWE 安裝在電動(dòng)微操縱器上，在倒置熒光顯微鏡的觀察下，通過(guò)微操縱器將電極尖端的Ag NW精準(zhǔn)地插入到單個(gè)PC12細(xì)胞內(nèi)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀納米線的表征

在采用多元醇法合成Ag NWs 的過(guò)程中，AgNO3和PVP 之間的摩爾比、金屬鹽種類等都會(huì)對(duì)Ag NWs 的形貌尺寸產(chǎn)生影響。因此，在制備Ag NWE 之前，首先對(duì)合成Ag NWs的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)通過(guò)倒置熒光顯微鏡對(duì)不同摩爾比的AgNO3與PVP 以及不同金屬鹽合成的Ag NWs進(jìn)行形貌表征。如圖2 a所示，當(dāng)AgNO3與PVP之間的摩爾比為1∶2，金屬鹽為FeCl3時(shí)，Ag NWs的長(zhǎng)度較短，大約為15 μm，并且其產(chǎn)率較低。隨后，通過(guò)提高PVP 濃度將摩爾比調(diào)節(jié)至n（AgNO3）∶n（PVP）=1∶6，從圖2 b中可以觀察到，Ag NWs的長(zhǎng)度有所增加，但其產(chǎn)率并沒(méi)有顯著提高，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的PVP完全包覆了銀顆粒晶種，導(dǎo)致其無(wú)法在一維方向上優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)[11]。最終，將AgNO3與PVP之間的摩爾比調(diào)節(jié)為1∶3，如圖2c 所示，產(chǎn)物以Ag NWs 為主，并且其在分散液中具有較好的分散性。另外，文獻(xiàn)表明Fe3+和Cu2+被EG還原后能有效清除反應(yīng)體系中的氧，使一維生長(zhǎng)的銀顆粒晶種不會(huì)因?yàn)檠趸芙?，同時(shí)Fe3+作用要強(qiáng)于Cu2+，但還原后的金屬離子可能會(huì)占據(jù)銀顆粒晶種上的高能量位點(diǎn)缺陷，從而導(dǎo)致溶液中Ag 原子無(wú)法在這些高能量位點(diǎn)缺陷上聚集和生長(zhǎng)[12]，所以在合成Ag NWs 時(shí)選擇CuCl2作為金屬鹽。

圖2 不同反應(yīng)條件下合成的Ag NWs 在倒置熒光顯微鏡下的圖像Fig.2 Images of Ag NWs synthesized under different reaction conditions under inverted fluorescence microscopy

掃描電鏡分析表征Ag NWs 的形貌見(jiàn)圖3，Ag NWs的長(zhǎng)約30 μm，直徑約Φ200 nm，前后均一。結(jié)果證明，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件成功制備了符合形貌要求的Ag NWs。

圖3 Ag NWs（對(duì)應(yīng)于圖2 c）的掃描電鏡圖像及其放大圖像Fig.3 SEM images of Ag NWs（corresponding to Fig.2c）and their enlarged images

2.2 銀納米線電極的表征

采用簡(jiǎn)單的靠取法制備了以CFE 為基底的Ag NWE，從圖4 a 可以看出，Ag NW 與碳纖維連接良好，并且暴露于尖端的工作段Ag NW 呈筆直狀且直徑均一，其長(zhǎng)度為20 μm 左右，這確保了電極在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)時(shí)有足夠的插入深度，符合納米電極應(yīng)具備的尺寸要求。為了進(jìn)一步從功能上驗(yàn)證制備的Ag NWE 是否成功電連接，通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)其進(jìn)行了電化學(xué)性能表征。將制備的CFE 和Ag NWE 分別置于含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安法測(cè)試，如圖4 b 所示，CFE 和Ag NWE 的循環(huán)伏安都呈“S”型，符合超微電極的循環(huán)伏安特征。但與CFE 相比，Ag NWE 的循環(huán)伏安曲線具有明顯的氧化還原峰，表明其電流信號(hào)較強(qiáng)，進(jìn)一步證明Ag NW 與CFE 之間形成了緊密的電連接，表明制備的Ag NWE 具有良好的導(dǎo)電性。

圖4 Ag NWE的掃描電鏡圖像及其在含有1 mmol/L K3Fe（CN）6的1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 SEM image of Ag NWE and its cyclic voltammetry in 1 mol/L KCl solution containing 1 mmol/L K3Fe（CN）6

此外，為了將制備的Ag NWE 應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)，其應(yīng)具有良好的機(jī)械性能，以減少操作中的損毀。如圖5 所示，制備的Ag NWE 在插入單個(gè)PC12 細(xì)胞時(shí)，Ag NW 并沒(méi)有出現(xiàn)折斷或彎曲的現(xiàn)象，而細(xì)胞在電極插入過(guò)程中發(fā)生輕微變形，并且可以從培養(yǎng)皿底部被電極抬起，直觀地證明了所制備電極的機(jī)械性能優(yōu)異，可以滿足在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的操作中對(duì)電極機(jī)械性能的要求。

圖5 Ag NWE在插入單個(gè)PC12細(xì)胞過(guò)程中不同階段的明場(chǎng)圖像（比例尺為50 μm）Fig.5 Brightfield images of Ag NWE at different stages during insertion into single PC12 cell（Scale = 50 μm）

3 結(jié)論

本研究首先通過(guò)改變PVP與AgNO3之間的摩爾比、金屬鹽的種類，合成了長(zhǎng)度為30 μm 左右、直徑約為200 nm 的Ag NWs，然后采用靠取法成功制備了以CFE為基底的Ag NWE。電極經(jīng)過(guò)一系列表征后，結(jié)果證明，其具有合適的尺寸、優(yōu)異的導(dǎo)電性和良好的機(jī)械穩(wěn)定性，可以滿足在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的實(shí)際需求。后續(xù)將尋找合適的活性材料和電極修飾方式，以構(gòu)建高性能的單細(xì)胞納米工具。