曹利慧，肖梓瑩，曹作佳，李勝杰，高 兢

（衡水學院應用化學系，河北衡水 053000）

馬齒莧是馬齒莧科一年生草本植物，藥食兼用，具有抗菌作用，在我國民間常被用來治療因腸道細菌所引起的腸炎腹瀉，被人們稱為“天然抗生素”[1]。研究發(fā)現，馬齒莧中富含多酚、多糖、生物堿和黃酮等生物活性物質[2-3]，其中的多酚物質具有抗氧化[4]、抑菌[5]、抗衰老[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]等藥理作用，尤其在抗氧化和抗菌抗炎方面有更好的效果。因此，馬齒莧多酚在食品工業(yè)、醫(yī)藥加工和化妝行業(yè)都具有良好的發(fā)展前景和重要的應用價值[9]。而多酚提取率是影響其應用發(fā)展的瓶頸，因此，選擇優(yōu)良的提取方式，提高馬齒莧多酚的提取率具有重要意義。本文采用超聲波輔助提取馬齒莧多酚，研究影響提取效果的因素，通過單因素實驗和響應面實驗相結合，得到馬齒莧多酚的最佳提取工藝條件。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧，采自衡水市市郊，去殘根雜質，洗凈，自然陰干后置于65℃烘箱中烘干。取出，用高速萬能粉碎機粉碎，過60目篩成干粉，備用。

沒食子酸；福林酚；無水碳酸鈉；無水乙醇。

722G 可見分光光度計，上海儀點分析儀器有限公司；TD4臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；BL6-180A超聲波清洗機，上海比朗儀器有限公司；RE-52C旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2 總酚含量的測定

1.2.1 標準曲線的繪制

稱取0.010 0 g 沒食子酸，加入95%乙醇，定容至100 mL 容量瓶，得到濃度為0.1 mg/mL 的沒食子酸標準溶液。準確移取0～1.00 mL 標準溶液，其間間隔0.20 mL，用95%乙醇定容至1.00 mL?；旌暇鶆?，加福林酚原液0.70 mL、蒸餾水5.00 mL，搖勻，靜置反應3 min。然后加碳酸鈉溶液3.00 mL 和蒸餾水0.30 mL，混勻避光50 min。將溶液置于分光光度計中于760 nm波長處測其吸光值。為了減小誤差，進行三次平行試驗。

1.2.2 馬齒莧總酚含量的測定

取樣品提取液稀釋合適倍數后，采用福林酚比色法測定多酚含量。多酚含量計算公式：

式中：n 為稀釋倍數；C 為馬齒莧總酚質量濃度，mg/mL；V 為提取液的體積，mL；m 為馬齒莧粉末質量，g。

1.3 總酚提取的單因素實驗

1.3.1 超聲時間對馬齒莧多酚提取率的影響

用電子天平稱取1.000 g 馬齒莧粉末，取濃度為20%的乙醇，依據料液比1∶20（g/mL）、提取溫度60℃，設置超聲時間在80 min、90 min、100 min、110 min、120 min下提取，測總酚的含量。

1.3.2 乙醇濃度對馬齒莧多酚提取率的影響

用電子天平稱取1.000 g 馬齒莧粉末，在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度為60℃、超聲時間為110 min 條件下，按不同乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%）提取，測總酚含量。

1.3.3 溫度對馬齒莧多酚提取率的影響

用電子天平稱取1.000 g 馬齒莧粉末，按料液比1∶20（g/mL）混合，乙醇濃度為30%，設定超聲時間110 min，測定清液多酚含量，研究溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃對多酚提取率的影響。

1.3.4 料液比對馬齒莧多酚提取率的影響

用電子天平稱取1.000 g 馬齒莧粉末，控制超聲時間110 min、提取溫度為60℃，在乙醇濃度為30%的情況下，以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g/mL）分別進行總酚提取，進行總酚含量的測定。

1.4 響應面實驗

以單因素實驗為基礎進行優(yōu)化，探究提取馬齒莧總酚的最佳提取條件。以超聲時間、乙醇濃度、提取溫度和料液比4因素3水平組合得到29組試驗，通過計算多酚提取率得到提取馬齒莧總酚的最優(yōu)條件（表1）。

表1 設計試驗因素與水平表

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

以沒食子酸為對照品，得出標準方程：y = 0.010 34x + 0.033 1，R2為0.998 5，標準曲線如圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲時間對多酚提取率的影響

超聲時間對多酚提取率的影響見圖2。從圖2 可看出，在超聲時間90～110 min 范圍內提取率隨時間的增加而變大，多酚提取率平均值最高為超聲時間110 min 時，平均提取率為81.7%，此時馬齒莧中多酚已提取完全。再延長時間，提取率下降?？赡苁嵌喾优c空氣中的氧發(fā)生了反應，導致提取率下降。因此，初步確定110 min 的超聲時間是馬齒莧多酚最佳提取條件。

圖2 超聲時間對多酚提取率的影響

2.2.2 乙醇濃度對多酚提取率的影響

乙醇濃度對多酚提取率的影響見圖3。由圖3 可得，當乙醇濃度增加，提取率先變大，后變小，再變大，這是由于水溶性總酚主要在細胞的大液泡中分散，而不溶于水的總酚附著在細胞壁上，能與蛋白質或多糖結合形成氫鍵。低濃度的溶劑會進入細胞，而高濃度的溶劑會使蛋白發(fā)生變性，從而阻礙總酚的傳遞，降低提取率?？紤]到節(jié)省溶劑，初步確定30%的乙醇濃度是馬齒莧多酚最佳提取條件。

圖3 乙醇濃度對多酚提取率的影響

2.2.3 提取溫度對多酚提取率的影響

提取溫度對多酚提取率的影響關系見圖4。由圖4可得，在30℃～50℃時，提取溫度對總酚提取率基本沒有明顯影響，可能因為沒有達到多酚物質擴散的最低溫度；當溫度在60℃時，提取率最大，可能因溫度上升對多酚的擴散、溶出更有利；再提升溫度，提取率明顯下降?？赡芤驕囟忍?，破壞了多酚，因此，可認為60℃是馬齒莧中總酚提取的最佳條件。

圖4 提取溫度對多酚提取率的影響

2.2.4 料液比對多酚提取率的影響

料液比對多酚提取率的影響見圖5，由圖5 可知，料液比對多酚提取率影響整體是先增后減，在1∶25（g/mL）之前，提取率隨料液比增大而增大，而在1∶25（g/mL）時，提取率達到最大；再加大料液比，平均提取率下降，表明這時多酚物質已不再溶出。因此，初步確定料液比為1∶25（g/mL）為最佳。

圖5 料液比對多酚提取率的影響

2.2.5 響應面試驗設計及結果

使用Design Expert 8.0.6 進行數據分析，其響應面試驗設計及結果如表2。

表2 響應面試驗設計及響應結果

將數據擬合，獲得多酚提取率（Y）與提取時間（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）、液料比（D）之間關系的二元多項回歸方程：

Y=129.60+4.08A+1.17B+1.08C+9.00D-0.750 0AB-3.00AC-1.000 0AD+3.25BC+4.50BD-0.508A2-10.38B2-9.01C2-5.63D2（見表3）

表3 回歸模型各項方差分析

由表3 可知，F=2.50，說明該模型顯著，只有4.87%的概率會出現這么大的F 值，P＜0.050 0，說明該模型項顯著。表3中P=0.182 3且P ＞0.05，說明失擬檢驗不顯著，該回歸模型具有可行性。根據表3 可知，C、AD、B2是重要的模型項，多酚得率顯著（p＜0.05）。擬合不足F=2.63，相對于純誤差而言并不顯著。由回歸模型各項方差分析可知，馬齒莧總酚提取影響程度為：乙醇濃度＞超聲時間＞料液比＞提取溫度。

2.2.6 雙因素的交互作用對總酚提取率的影響

雙因素的交互結果如圖6 所示，由圖6 可知，圖（1）（2）（3）（5）變化曲面均陡峭，說明其對馬齒莧多酚提取率有顯著影響。而圖（4）（6）的變化曲面較緩，表明其對馬齒莧多酚提取率的影響弱一些。通過模型的擬合分析，預測的最佳提取條件：超聲時間114 min，乙醇濃度34%，提取溫度66℃，料液比為1∶28（g/mL）時，多酚得率最高，為44.02%。進行三次平行試驗驗證，得到平均提取率為43.85%，與預測值44.02%相差較小，說明馬齒莧總酚提取條件可行、合理。

圖6 兩因素交互作用響應面圖

3 結論

超聲波輔助提取馬齒莧多酚與傳統(tǒng)水浴浸提法相比，可以縮短提取時間，提高提取效率。本實驗采用超聲波法提取馬齒莧總酚，先進行單因素實驗，考查了超聲時間、乙醇濃度、提取溫度、料液比四個單因素對總酚提取率的影響；在單因素實驗基礎上再進行響應面實驗，分析得出結論：影響馬齒莧多酚提取的因素主次順序：乙醇濃度＞超聲時間＞料液比＞提取溫度。當超聲時間為114 min，乙醇濃度為34%，提取溫度為66℃，料液比為1∶28（g/mL）時，多酚得率最高，為44.02%。