葛 林，劉英英，周芳名，展凌玲

（蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)院，江蘇 太倉 215411）

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）廣泛存在于自然界中，如哺乳動物組織、植物、真菌、細(xì)菌等[1-4]。該酶是一種應(yīng)用廣泛的糖苷水解酶，它能高效水解多種末端含有非還原性鼠李糖殘基的天然化合物，如水解蘆丁為異槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 為淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷為普魯寧等[4]。此外，少數(shù)α-L-鼠李糖苷酶還能以L-鼠李糖為供體，通過逆水解反應(yīng)催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚類化合物鼠李糖基化等[6，7]。迄今為止，根據(jù)CAZy 數(shù)據(jù)庫，α-L-鼠李糖苷酶分屬于三大糖苷水解酶家族，即GH13 家族、GH78家族和GH106 家族[8]，其中大部分屬于GH78 家族。此外，α-L-鼠李糖苷酶是一種重要的酶，在食品和制藥工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。然而，目前報道的α-L-鼠李糖苷酶普遍產(chǎn)量不高，到目前為止，全球還沒有商品化的α-L-鼠李糖苷酶產(chǎn)品，這極大限制了該酶在工業(yè)上的應(yīng)用。

大腸桿菌是遺傳背景最清楚的菌株，其具有培養(yǎng)成本低、抗污染能力強(qiáng)、生長周期短、蛋白表達(dá)量高等優(yōu)勢，已經(jīng)成為最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。采用高密度發(fā)酵技術(shù)，能顯著提高所培養(yǎng)的菌體密度，最終增加單位體積單位時間內(nèi)目的產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，縮減生產(chǎn)周期，提升經(jīng)濟(jì)效益，已經(jīng)在工業(yè)中有很廣泛的應(yīng)用[9]。在大腸桿菌高密度發(fā)酵中，大多采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式，以實(shí)現(xiàn)高密度的大腸桿菌和所需的蛋白質(zhì)生產(chǎn)[10]。這種補(bǔ)料方式一方面可以避免因某些營養(yǎng)成分初始濃度過高而出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面又能夠防止因限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成。重組大腸桿菌高密度發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，需要對其生長的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如葡萄糖進(jìn)料速率、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH等。葡萄糖是一種便宜且速效碳源，在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)于其他碳源。但是，在有氧條件下，過多的葡萄糖會導(dǎo)致大腸桿菌代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生。最常見的副產(chǎn)物是乙酸，它是由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）/乙酸激酶（ACKA）和丙酮酸氧化酶（POXB）兩種途徑產(chǎn)生的[11]，主要原因是加入中央代謝系統(tǒng)的碳與細(xì)胞呼吸或三羧酸循環(huán)的有限能力之間不平衡[12]。乙酸的積累通常發(fā)生在大腸桿菌的快速生長期，尤其是在所需蛋白質(zhì)合成的誘導(dǎo)階段，會抑制生長和產(chǎn)物的形成[13]。因此，對于補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)重組耐熱α-L-鼠李糖苷酶來說，構(gòu)建一種避免補(bǔ)料不足或過量的補(bǔ)料策略是極其重要的。在確保溶解氧恒定的情況下，誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH對高密度發(fā)酵過程誘導(dǎo)后代謝乙酸的積累量產(chǎn)生影響[14]。在高溫條件下加速細(xì)胞的新陳代謝和生長，導(dǎo)致大量乙酸的形成[15]。誘導(dǎo)后的pH值是通過添加氨水形成銨鹽來降低乙酸濃度的關(guān)鍵因素。然而，高濃度的NH4+對能源效率和大腸桿菌的生長有負(fù)面影響[15]。到目前為止，關(guān)于調(diào)控乙酸來提高耐熱α-L-鼠李糖苷酶產(chǎn)量的影響還未見報道。

在我們前期的研究中，克隆了來源于Thermoclostridium stercorariumDSM 2910 的GH78 家族的α-L-鼠李糖苷酶（TstRhaA），在最優(yōu)的搖瓶水平最佳表達(dá)條件下，該酶最高酶活力僅有25.2 U/mL，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化需求。在本研究中，我們研究了在7.5 L 發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)耐熱α-L-鼠李糖苷酶時，葡萄糖補(bǔ)料策略、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH對副產(chǎn)物乙酸生成量及TstRhaA酶產(chǎn)量的影響，最終發(fā)現(xiàn)通過控制乙酸的生成量，能夠顯著提高TstRhaA 的產(chǎn)酶量，最高酶活力達(dá)到589.0 U/mL，研究結(jié)果為大規(guī)模生產(chǎn)TstRhaA提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

重組基因工程大腸桿菌BL21（DE3）/pET20b-TstRhaA由筆者前期構(gòu)建并保存，目的基因來自于Thermoclostridium stercorariumDSM 2910。

1.2 主要試劑

二水合磷酸二氫鈉、三水合磷酸氫二鉀、葡萄糖、硫酸銨、七水合硫酸鎂、乙二胺四乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-硝基苯基-α-L-鼠李吡喃糖苷（pNPR），Sigma 公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID公司；氨芐青霉素鈉（Amp）、異丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）、消泡劑、氯化鈉、檸檬酸、氨水，上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 主要儀器

Agilent 7820A 氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；JY98-III DN 型超聲波破碎儀，南京思麥?zhǔn)⑨t(yī)療生物科技有限公司；BioFlo 310 型發(fā)酵罐，蘇州牧笛自動化科技有限公司；D-1 型自動蒸氣滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；ZHWY-2102C 搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；BS124S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ZHWY-10X 水浴鍋，上海智城分析儀器制造有限公司；多功能酶標(biāo)儀，鞏義市英峪予華儀器廠；AIR TECH US-1300L-U 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；艾本德5418R臺式高速冷凍離心機(jī)，上海璞珉科技有限公司；UV9000紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；LC-SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，上海力辰儀器科技有限公司。

1.4 主要溶液與培養(yǎng)基

1.4.1 主要溶液

（1）IPTG 溶液（1 mmol /L）：精確稱取2.383 g IPTG，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）Amp 溶液（100 mg/mL）：精確稱取1 g 氨芐青霉素鈉，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）pNPR 溶液（5 mmol/L）：精確稱取14.3 mg pNPR，加入適量無菌水溶解，定容至10 mL，用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 主要培養(yǎng)基

（1）LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂15 g/L。

（2）種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：二水合磷酸二氫鈉4.2 g/L，三水合磷酸氫二鉀8.7 g/L，酵母提取物50.0 g/L，葡萄糖30 g/L，硫酸銨5.5 g/L，七水合硫酸鎂2.5 g/L，乙二胺四乙酸1.1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，消泡劑0.3 g/L。

（4）補(bǔ)料培養(yǎng)基：二水合磷酸二氫鈉12.6 g/L，三水合磷酸氫二鉀26.0 g/L，酵母提取物200 g/L，葡萄糖800 g/L，硫酸銨16.5 g/L，七水合硫酸鎂20 g/L，乙二胺四乙酸3.3 g/L，微量元素混合液3 mL/L，消泡劑0.3 g/L。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)TstRhaA

（1）種子活化

取-80℃甘油保存的菌種，在超凈工作臺中于氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)皿上進(jìn)行四區(qū)劃線法劃線，倒置放37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～20 h。

（2）種子液培養(yǎng)

從活化平板上挑取單菌落于50 mL 種子培養(yǎng)基（含50 mg/L Amp）中，放入37℃、180 r/min 的搖床中培養(yǎng)12～16 h。然后按照2%的接種量接入到含有150 mL 新鮮發(fā)酵液體培養(yǎng)基（含50 mg/L Amp）中，于37℃、1 800 r/min 條件下培養(yǎng)10 h。

（3）發(fā)酵罐培養(yǎng)

在7.5 L發(fā)酵罐中裝入3.0 L的初始發(fā)酵培養(yǎng)基（含50 mg/L Amp），接種量為2%，攪拌速度為300～1 200 rpm，控制溶氧（DO）≥15%，空氣流速為60 L/h，培養(yǎng)溫度為37℃，用100%的氨水和25%的HCl 來調(diào)節(jié)發(fā)酵pH 在7.0±0.1。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)9 h 時，將IPTG 以固定的速率添加到初始培養(yǎng)基中，開始誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。

通過溶氧（DO）或pH 值的變化來反饋生物反應(yīng)器中的剩余葡萄糖，然后采用指數(shù)流加和兩階段流加策略啟動分批補(bǔ)料[10，16]。由底物基本質(zhì)量平衡可知，不同比生長速率下的補(bǔ)料速率（F，mL/h）為：

式中：μ—比生長速率（h-1）；μset—誘導(dǎo)前比生長速率；μ′set—誘導(dǎo)后比生長速率；X0—細(xì)胞初始濃度（g/L）；V0—初始培養(yǎng)體積（L）；YX/S—細(xì)胞對葡萄糖的理論產(chǎn)率；SF—補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度；t—培養(yǎng)時間。

基于上述結(jié)果，進(jìn)一步研究不同誘導(dǎo)溫度（30℃、33℃、37℃、42℃）和不同誘導(dǎo)pH（6.8、7.0、7.2、7.4）對重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)TstRhaA的影響。

1.5.2 TstRhaA酶活力測定方法

以5 mmol/L pNPR 為底物。反應(yīng)體系：75 μL 50 mmol/L 檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液，20 μL 底物，混勻預(yù)熱后加入5 μL 酶液，在酶的pH 6.5 和65℃下反應(yīng)10 min。之后加入0.3 mL 1 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，立即冷卻，混勻并離心5 min 后在405 nm條件下測定其吸光值。以不加酶液的反應(yīng)體系做對照。

TstRhaA 酶活力單位（U）定義為：在pH 6.5 和65℃條件下反應(yīng)，每分鐘水解相應(yīng)底物pNPR 釋放1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

酶活力計算公式（U/mL）= c×V1/（t×V2）×N

式中：c—由對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)方程計算出的酶反應(yīng)后的對硝基苯含量（μmol）；V1—反應(yīng)體系總體積（mL）；t—酶與底物反應(yīng)時間（min）；V2—反應(yīng)體系中酶液的體積（mL）；N—酶液的稀釋倍數(shù)。

1.5.3 乙酸濃度測定方法

取2 mL 發(fā)酵液，在4℃、10 000 rpm 下離心1 min，取1 mL上清液于5 mL離心管中，再加入0.2 mL 50%硫酸和1 mL乙醚，混勻后獲得樣品，經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾到色譜瓶中，用氣相色譜儀檢測乙酸的濃度。氣相色譜方法：柱溫在70℃的初始溫度保持3 min，然后以每分鐘8℃的增量升至230℃，并保持3 min（30 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫）；載氣（N2）的流速為2 mL/min；前端檢測器（FID）的溫度為300℃；尾氣的流速為25.00 mL/min；H2流速為30.00 mL/min；空氣流速為400 mL/min[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 指數(shù)流加培養(yǎng)對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在指數(shù)流加培養(yǎng)中，大腸桿菌的比生長速率由限制性營養(yǎng)的進(jìn)料速率決定[18]。當(dāng)μ超過閾值時，過量的葡萄糖通常會迫使大腸桿菌通過PTA-ACKA 和POXB 合成途徑產(chǎn)生乙酸，但當(dāng)μ 低于閾值時，就不會產(chǎn)生乙酸[19]。盡管氧化乙酸可以產(chǎn)生額外的ATP 來支持大腸桿菌的更快生長，但乙酸的過度積累對重組大腸桿菌生產(chǎn)TstRhaA有不利影響。因此，減少乙酸形成和增加大腸桿菌生物量的最佳方法是調(diào)整比生長速率，這有利于增加重組蛋白的表達(dá)[14]。

從圖1a 中可以看出，當(dāng)比生長速率為0.1 h-1時，乙酸含量開始迅速下降，誘導(dǎo)后最終濃度約為0 g/L，這可能是因?yàn)檠a(bǔ)充的碳源低于一定的閾值。此外，發(fā)酵17 h時，大腸桿菌的生物量（0.1 h-1）達(dá)到最大值，然后生物量緩慢下降，這表明大腸桿菌開始老化和死亡。結(jié)果表明，在0.1 h-1的低比生長速率下，補(bǔ)充的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足其自身生長的需要，并且菌株在發(fā)酵后期缺乏生長。當(dāng)比生長速率為0.2 h-1時（圖1b），誘導(dǎo)后乙酸含量開始逐漸降低，乙酸的終濃度為2.56 g/L，TstRhaA的最高活性達(dá)到306.5 U/mL，干細(xì)胞重量（DCW）為45.2 g/L。盡管乙酸的濃度保持在相對較高的水平，但它減緩了大腸桿菌的生長，并間接促進(jìn)了大腸桿菌增加TstRhaA 的產(chǎn)量。當(dāng)比生長速率為0.3 h-1時（圖1c），在誘導(dǎo)發(fā)酵最后，發(fā)酵液中的乙酸含量高于3.2 g/L。這是因?yàn)楹醚醢l(fā)酵中碳源的補(bǔ)充超過了細(xì)胞生長的要求，導(dǎo)致培養(yǎng)物中大腸桿菌產(chǎn)生過量的乙酸，從而抑制了細(xì)胞生長和TstRhaA的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酸的產(chǎn)生對大腸桿菌的細(xì)胞生長和重組α-L-鼠李糖苷酶蛋白的產(chǎn)生有極其不利的影響，不同比生長速率的指數(shù)補(bǔ)料可以明顯調(diào)節(jié)乙酸的積累。

圖1 不同比生長速率的指數(shù)流加培養(yǎng)對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of exponential fed-batch with different specific growth rates on the enzyme production of recombinant E.coli by high-density fermentation

2.2 兩階段指數(shù)流加培養(yǎng)對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

為了實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的高密度培養(yǎng)和重組耐熱TstRhaA 的大量生產(chǎn)，我們采用了基于比生長速率和誘導(dǎo)后葡萄糖殘余量的兩階段葡萄糖補(bǔ)料策略來控制菌體生長和乙酸形成[16，20]。在誘導(dǎo)前階段，按照指數(shù)補(bǔ)料速率，使菌體以0.2 h-1的比生長速率生長。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)8 h 時，加入IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，并基于梯度遞減方法改變補(bǔ)料速率。當(dāng)μ′set為0.14 h-1時（圖2a），發(fā)酵后期的DCW 和乙酸含量迅速下降，這可能是有限的碳源無法支持大腸桿菌正常生長的主要原因。當(dāng)μ′set為0.16 h-1時（圖2b），在誘導(dǎo)結(jié)束后，盡管大腸桿菌產(chǎn)生的乙酸濃度低于0.9 g/L，DCW 達(dá)到52.4 g/L，但最高酶活性僅為286.2 U/mL。當(dāng)μ′set為0.18 h-1時（圖2c），乙酸濃度保持在1.6 g/L 左右，DCW 僅有44.3 g/L，比μ′set為0.16 h-1時降低了8.1 g/L，但最高酶活為364.8 U/mL，其是μ′set為0.16 h-1時的1.27倍，是搖瓶培養(yǎng)的14.5倍。結(jié)果表明：在誘導(dǎo)后期，乙酸的積累隨著μ′set的梯度增加而增加；在微生物發(fā)酵過程中，不同誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后比生長速率的指數(shù)流加培養(yǎng)可以很好地控制乙酸的積累。

圖2 兩階段不同比生長速率指數(shù)流加培養(yǎng)對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of exponential fed-batch with two-stage specific growth rate on the enzyme production of recombinant E.coli by high-density fermentation

2.3 誘導(dǎo)溫度對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

一般來說，誘導(dǎo)溫度是通過控制重組大腸桿菌的生長速率和代謝速度來調(diào)節(jié)乙酸的關(guān)鍵參數(shù)。研究表明，低溫通?？梢苑乐怪亟M蛋白的錯誤折疊，并增加大腸桿菌中的正確表達(dá)[21]。因此，在上述最優(yōu)條件的基礎(chǔ)上，研究了不同誘導(dǎo)溫度對TstRhaA 產(chǎn)量的影響。研究結(jié)果如圖3所示：當(dāng)誘導(dǎo)溫度過低時，TstRhaA的酶活力和DCW 均較低，這是因?yàn)榈蜏叵轮亟M大腸桿菌的生長受到影響，從而影響了TstRhaA 的產(chǎn)量。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為33℃時，TstRhaA 的酶活力是最高的，達(dá)到468.5 U/mL，是在30℃誘導(dǎo)下的1.6 倍；乙酸含量是最低的，只有1.3 g/L，是在30℃誘導(dǎo)下的72%；DCW 是最高的，達(dá)到49.5 g/L，是在30℃誘導(dǎo)下的1.31 倍。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃和42℃時，TstRhaA 的酶活力和DCW 均逐漸降低，而乙酸含量顯著升高，這是因?yàn)楦邷丶铀倭思?xì)胞的代謝轉(zhuǎn)移，并在恒定的溶氧水平下快速積累乙酸，從而抑制了大腸桿菌的生長和TstRhaA的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明：在高密度發(fā)酵過程中，低溫雖然可以防止重組蛋白的錯誤折疊，但是溫度太低會影響菌體生長速率，從而影響TstRhaA 的酶產(chǎn)量；TstRhaA 的酶活力和DCW 與乙酸含量呈負(fù)相關(guān)；適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)溫度可以控制乙酸的積累，并提高耐熱酶的產(chǎn)量。

圖3 誘導(dǎo)溫度對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of induction temperature on high-density fermentation of recombinant E.coli.

2.4 誘導(dǎo)pH對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

很多研究較少關(guān)注酸度或堿度對高密度培養(yǎng)過程中大腸桿菌產(chǎn)生的乙酸積累的影響[22-23]。pH 的影響是復(fù)雜的，它與其他條件有關(guān)，如DO、生長階段和大腸桿菌自身代謝變化等[24]。發(fā)酵液的酸堿度通常被誤認(rèn)為是保證適宜細(xì)菌生長的酸堿度條件，而忽略了pH 對乙酸形成的調(diào)節(jié)作用。在誘導(dǎo)前的pH（pH 7.0）不改變的情況下，本文研究了在誘導(dǎo)后階段通過梯度遞減法調(diào)節(jié)誘導(dǎo)pH 獲得乙酸的最適pH，如圖4所示，當(dāng)誘導(dǎo)pH 為7.2時，DCW達(dá)到69.6 g/L，TstRhaA的酶活力為589.0 U/mL，達(dá)到了最高水平，與搖瓶培養(yǎng)相比提高了23.4 倍。此時，乙酸的濃度被進(jìn)一步控制到非常低的水平，一直保持在0.8 g/L 以下，與其他誘導(dǎo)pH 相比處于最低水平，其可能原因是培養(yǎng)基中的乙酸變?yōu)殇@鹽，并且代謝成分抑制乙酸的形成[25]。但是當(dāng)誘導(dǎo)pH為7.4時，乙酸含量顯著提升，可能的原因是高pH 誘導(dǎo)大腸桿菌的代謝酶參與精氨酸和谷氨酸的分解代謝途徑，將碳轉(zhuǎn)化為酸，而不是產(chǎn)生堿性胺[23]。研究結(jié)果表明，在誘導(dǎo)后階段通過調(diào)整誘導(dǎo)pH能夠?qū)崿F(xiàn)對乙酸的調(diào)控；適當(dāng)?shù)膒H不僅可以加速細(xì)菌的生長，而且可以調(diào)節(jié)和控制乙酸的形成。

圖4 誘導(dǎo)pH對重組大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of induction temperature on high-density fermentation of recombinant E.coli.

3 結(jié)論

本文研究了指數(shù)流加培養(yǎng)、兩階段指數(shù)流加培養(yǎng)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH對重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，研究結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中通過調(diào)節(jié)乙酸的積累能夠顯著提升酶的產(chǎn)量。最終確定了最佳發(fā)酵工藝：誘導(dǎo)前比生長速率0.2 h-1，誘導(dǎo)后比生長速率0.18 h-1，誘導(dǎo)溫度33℃，pH 7.2。在最佳發(fā)酵工藝條件下，乙酸濃度始終保持在0.8 g/L 以下，DCW 最大為69.6 g/L，最高酶活力為589.0 U/mL，是搖瓶發(fā)酵的23.4 倍，最終實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)TstRhaA。