陳志琳,杜洪志,何 麗,覃春葉,李 瑋

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025)

0 引言

八角楓為八角楓科植物八角楓(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)及瓜木(Alangium.platanifolium(Sieb．et Zucc.)Harms.)的干燥細(xì)須根(白龍須)或干燥支根(白金條)。具有舒經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、散瘀止痛等功效,主要用于治療四肢麻木、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明,八角楓主要含有生物堿[2-4]、酚苷、木脂素[5-6]、揮發(fā)油[7-8]等化學(xué)成分,具有肌松及收縮平滑肌[9-11]、抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛[12]等藥理作用。由于藥材受不同地理環(huán)境、土壤微生物、采收時(shí)節(jié)、加工炮制等綜合因素的影響,導(dǎo)致其藥材質(zhì)量參差不齊,因此,建立一種整體、全面的八角楓藥材質(zhì)量控制方法尤為重要[15-16]。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC以黔產(chǎn)10 個(gè)批次的八角楓藥材為研究對(duì)象,建立了黔產(chǎn)八角楓的 HPLC指紋圖譜,為完善八角楓藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀;分析天平; SHA-B數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);沃特浦超純水機(jī)。對(duì)照品八角楓堿(批號(hào)C102642-210317)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,購(gòu)自貴州迪大生物科技有限公司;甲醇、乙酸、乙腈為色譜純,其余試劑為分析純。實(shí)驗(yàn)用八角楓藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)杜洪志老師鑒定為八角楓科植物八角(Alangiumchinense(Lour.)Harms.)的須根,共10 批,產(chǎn)地及采集日期見表1。

表1 八角楓藥材信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品八角楓堿適量,加含5%醋酸的30%甲醇溶液制成2 mg/mL的溶液,即得。

2.2 供試品溶液的制備

取八角楓藥材粉末(過3號(hào)篩)約2.0 g,置100 mL錐形瓶中,精密加入含5%醋酸的30%甲醇溶液25 mL,搖勻,稱定質(zhì)量,超聲提取50 min,放冷,補(bǔ)重,搖勻,濾過,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:HC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):259 nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積 :15 μL。流動(dòng)相為甲醇-緩沖液(0.2 g庚烷磺酸鈉,2.0 g磷酸二氫鉀,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.4 色譜信息完整性考察

為檢查色譜化學(xué)信息的完整性,取八角楓(編號(hào)S5) 供試品溶液適量,按上述條件進(jìn)樣分析,并將洗脫程序擴(kuò)展至90 min。色譜圖顯示,在58 min之后沒有出現(xiàn)其他色譜峰,表明采集60 min的HPLC色譜圖可以完整地表達(dá)八角楓的化學(xué)信息,見圖1。

圖1 樣品完整性

圖2 10批八角楓藥材HPLC指紋圖譜疊加圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取八角楓(編號(hào)S5) 供試品溶液適量,連續(xù)進(jìn)樣6次。對(duì)各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示RSD均小于3%,表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取八角楓(編號(hào)S5) 供試品溶液適量,在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h進(jìn)樣。記錄色譜圖,分別計(jì)算HPLC圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD,結(jié)果顯示RSD均小于3%,表明樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取八角楓(編號(hào)S5)供試品溶液適量,連續(xù)進(jìn)樣6次。記錄色譜圖,并計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD,結(jié)果顯示RSD均小于3%,表明重復(fù)性良好。

2.6 八角楓藥材指紋圖譜采集

2.6.1 共有峰和對(duì)照?qǐng)D譜的采集

運(yùn)用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版對(duì)10批次八角楓的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析,指定S7為參照?qǐng)D譜,采用中位數(shù)法,自動(dòng)匹配,多點(diǎn)校正生成對(duì)照?qǐng)D譜R,由生成數(shù)據(jù)的輸出結(jié)果得到8個(gè)共有峰,見圖 2。

2.6.2 相似度分析

使用中藥色譜指紋圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版進(jìn)行相似度分析,結(jié)果10批次八角楓與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度在0.801～0.994之間,結(jié)果表明收集的黔產(chǎn)八角楓藥材整體概貌有一定差異,結(jié)果見表3。

表3 黔產(chǎn)八角楓藥材指紋圖譜相似度

2.7 聚類分析

將生成的8個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 26.0軟件,采用組間連接法進(jìn)行Q型聚類分析。在類間距為15時(shí),10批次樣品聚為3類。其中產(chǎn)自凱里的2批八角楓藥材(S7、S8)聚為一類,產(chǎn)自畢節(jié)和遵義的2批聚為一類,其余6批聚為一類。

2.8 主成分分析及因子分析

以主成分貢獻(xiàn)率及特征值為依據(jù),對(duì)8個(gè)共有峰峰面積原始數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分因子分析。特征值和方差貢獻(xiàn)率見表4,其值累計(jì)為80.110%,表明所分析樣品中的大部分化學(xué)信息可以通過前三個(gè)組分反映出來。根據(jù)碎石圖(圖4)走勢(shì)可知,前三個(gè)成分的曲線陡峭,說明其為引起黔產(chǎn)不同批次八角楓差異性的主要原因。通過正交旋轉(zhuǎn),得到8個(gè)指標(biāo)在3個(gè)主成分中的旋轉(zhuǎn)成分矩陣,見表5。由表5可知,主成分1可以反映所有組分的信息;主成分2可以反映出1、2、5、7、8共5個(gè)指標(biāo)組分的信息;主成分3可以反映出2、3、4、8共4個(gè)指標(biāo)組分的信息。由八角楓藥材主成分分析三維圖可以看出,10批八角楓藥材被分為3大類,結(jié)果與聚類分析一致(圖3)。載荷圖(圖5)被用于描述圖像的特性,載荷代表的點(diǎn)到原點(diǎn)間的距離被用于衡量載荷的絕對(duì)值大小,絕對(duì)值越大,表明對(duì)主要分量的影響也就越大。10個(gè)批次八角楓的主成分綜合評(píng)分和排序結(jié)果見表5,采自遵義地區(qū)(S6)的八角楓綜合得分最高、品質(zhì)最佳。

圖3 八角楓指紋圖譜聚類樹狀關(guān)系

圖4 公共因子碎石圖

圖5 八角楓藥材主成分得分圖

表4 主成分方差分析

表5 八角楓藥材成分矩陣

表6 10批八角楓藥材主成分綜合得分及排序

綜合得分計(jì)算公式:

Y=0.39266M1+0.24809M2+0.16035M3

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

比較了乙腈-緩沖液和甲醇-緩沖液不同洗脫梯度對(duì)樣品的分離情況,結(jié)果流動(dòng)相為甲醇-緩沖液(0.2 g庚烷磺酸鈉,2.0 g磷酸二氫鉀,0.3 mL磷酸,定容至1000 mL),樣品中各峰分離度好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別考察229 nm、254 nm、259 nm、262 nm、273 nm共5個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下樣品的圖譜,發(fā)現(xiàn)259 nm下的基線平穩(wěn),出峰信息較豐富,而且色譜峰響應(yīng)值高。

3.3 色譜柱的選擇

分別考察了樣品在HC-C18柱、Alltech Alltima C18柱、Agilent HP-C18柱、Diamonsil C18柱等不同品牌色譜柱的分離情況,結(jié)果顯示色譜柱對(duì)樣品中色譜峰的分離影響不大,色譜條件在上述色譜柱上均能重現(xiàn)。

3.4 供試品樣品制備方法的選擇

對(duì)提取溶劑濃度(30%甲醇、35%甲醇、25%甲醇)、提取方法(超聲、回流提取),提取時(shí)間(30 min、50 min、70 min)、提取溶劑用量(25 mL 、30 mL、 20 mL)等條件進(jìn)行篩選,用含 5 %醋酸的30 %甲醇溶液25 mL,超聲提取50 min作為供試品溶液的提取方法。

本實(shí)驗(yàn)建立了八角楓藥材HPLC指紋圖譜共有模式,共標(biāo)示出8個(gè)共有峰;不同批次的八角楓藥材指紋圖譜相似度相對(duì)較高(大于0.80),說明黔產(chǎn)各地八角楓的質(zhì)量相對(duì)較穩(wěn)定。由主成分分析發(fā)現(xiàn),10個(gè)批次八角楓的主成分綜合評(píng)分和排序結(jié)果顯示,遵義地區(qū)(S6)的八角楓綜合得分最高。由聚類分析可知黔產(chǎn)各地的八角楓化學(xué)成分存在一定差異。