趙友芳,段學(xué)清,朱 晨,田維毅

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025)

0 引言

由于經(jīng)濟(jì)水平和生活質(zhì)量的不斷提高,當(dāng)代人養(yǎng)成了高油、高脂和高糖的飲食習(xí)慣,再加上不良的生活習(xí)慣人們很容易肥胖。而肥胖是極其需要關(guān)注的公共健康問題,它的發(fā)生發(fā)展會造成很多其他的疾病。例如糖尿病,據(jù)國際糖尿病協(xié)會預(yù)計,到2045年將會有7.83億人(占12.2%)患糖尿病,這儼然成為了當(dāng)今社會的公共衛(wèi)生問題之一[1]。2型糖尿病主要是由于胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞損傷所造成的[2],目前關(guān)于糖尿病尚且沒有很好的藥物治療,因此大量的藥物靶點研究顯得必要且迫切。

青黛的主要化學(xué)成分有靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮等[3],具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用[4],抗細(xì)菌和病毒[3]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]等作用。目前關(guān)于青黛治療糖尿病的研究較少,青黛聯(lián)合抗生素用于治療糖尿病皮膚病的效果好于抗生素組[7]。根據(jù)臨床研究,從肝論治青黛石膏湯加減治療非胰島素依賴性抵抗的臨床觀察顯示,66例患者的有效率是81.8%[8]。然而當(dāng)前關(guān)于青黛治療2型糖尿病的作用機(jī)制和靶點尚不明確。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分的建立

搜索網(wǎng)頁TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/)[9]在草本選項里面檢索“青黛”,設(shè)置篩選條件為OB(口服利用度)>30、DL(類藥性)>0.18,用Uniprot數(shù)據(jù)庫[9](https://www.uniprot.org/)將靶點的蛋白名轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)的基因名格式。

1.2 靶點的篩選與建立

利用 GeneCards 數(shù)據(jù)庫[10](https://www.genecards.org/)在“Explore a gene”選項下以“Type 2 diabetes”為搜索指令,篩選出與2型糖尿病相關(guān)的基因靶點,將2型糖尿病的基因靶點和青黛基因靶點導(dǎo)入Venny2.1.1網(wǎng)頁繪制維恩圖。

1.3 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述1.2步驟中篩選出的青黛-2型糖尿病的交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫[11](https://cn.string-db.org/)的List of name 列表中將Organisms選為Homo sapiens(人類)構(gòu)建靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI),置信度為0.9,將蛋白互作圖中前十蛋白篩選出來可視化分析,然后將青黛-成分-靶點可視化分析。

1.4 GO生物過程富集分析和KEGG信號通路

Step 1:將青黛-2型糖尿病的交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫[12](https://david.ncifcrf.gov/),點擊Analysis Wizard將共有基因復(fù)制到Gene List,Step 2:在“select Identifier”選項下選擇“official-gene-symbol”,再在“select species”選項下選擇“Homo sapiens”,Step 3:選擇gene list,Step 4:submit list。選擇go和kegg,將下載的文件導(dǎo)入基迪奧專業(yè)測序服務(wù)[13](https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft),選擇工具-氣泡圖進(jìn)行GO生物過程分析和KEGG的信號通路分析,結(jié)果以氣泡圖的形式展現(xiàn)。

1.5 藥物成分與靶點分子對接

將青黛所有的活性成分導(dǎo)入SYBYL-X 2.0軟件模板中進(jìn)行最小量化,“Docking suit-Dock Ligands”指令將STAT3、JUN、MAPK3三個靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)與青黛有效成分進(jìn)行一一對接,去除水分、修復(fù)側(cè)鏈和加氫并選擇自動尋找活性位點。STAT3的晶體結(jié)構(gòu)(ID:6NJS)、JUN的晶體結(jié)構(gòu)(ID:6Y3V)、MAPK3的晶體結(jié)構(gòu)(ID:3FHR)下載于RCSB PDB數(shù)據(jù)庫[14](https://www.rcsb.org/)。

2 結(jié)果

2.1 青黛活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫草本選項檢索“青黛”,總共得到青黛化學(xué)成分29個,以O(shè)B≥30、DL≥0.18 為篩選條件,篩選出活性成分9個:雙靛藍(lán)bisindigotin(MOL011100)、印地安indican(MOL011105)、10h茚多洛10h-indolo,[3,2-b],quinoline(MOL011332)、異靛藍(lán)Isoindigo(MOL011335)、靛Indigo(MOL001781)、6-(3-氧代辛啉-2-亞基)吲哚并[2,1-b]喹唑啉-12-酮6-(3-oxoindolin-2-ylidene)indolo[2,1-b]quinazolin-12-one(MOL001781)、茚地魯賓indirubin(MOL002309)、β-谷甾醇beta-sitosterol(MOL000358)、異牡荊素isovitexin(MOL002322)。

表1 青黛活性成分及靶標(biāo)數(shù)

2.2 青黛和2型糖尿病相關(guān)靶點的篩選

結(jié)果如圖1所示,2型糖尿病的基因總共有15668個,其中score>10共得到2型糖尿病相關(guān)的靶點基因5196個,青黛活性成分靶點236個,青黛靶點和2型糖尿病靶點的交集基因共204個,其中的靶點有:醇脫氫酶1C (alcohol dehydrogenase 1C,ADH1C)、前列腺素- 內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、前列腺素- 內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、核受體共激活劑2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)、膽堿能受體毒蕈堿3 (cholinergic receptor muscarinic 3,CHRM3)、膽堿能受體毒蕈堿1 (cholinergic receptor muscarinic 1,CHRM1)、類視黃醇X受體α(retinoid X receptor alpha,RXRA)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,ACHE)等。

圖1 青黛活性成分靶點和糖尿病靶點交集

2.3 青黛抗2型糖尿病的直接作用靶點拓?fù)鋮?shù)分析與成分靶點可視化

將青黛和2型糖尿病的交集靶點導(dǎo)入String在線網(wǎng)頁中(圖2),得到的治療2型糖尿病的靶點很多,根據(jù)度值大小篩選出前十靶點(表2)為:信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活劑3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、絲裂原活化蛋白激酶 3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶 14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、絲裂原活化蛋白激酶 1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1 (AKT serine/threonine kinase 1,AKT1)、腎上腺素受體 α 2A (adrenoceptor alpha 2A,ADRA2A)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、Sp1轉(zhuǎn)錄因子(Sp1 transcription factor,SP1)、表面活性劑蛋白B (surfactant protein B,SFTPB)、原癌基因(RELA proto-oncogene,RELA)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1),其中STAT3(Degree=47)、JUN(Degree=45)、MAPK3(Degree=44)等3個靶點綜合排名前三。節(jié)點代表潛在目標(biāo),邊代表靶點之間的相互作用,每個節(jié)點的邊數(shù)被定義為“degree”,即為度值。節(jié)點形狀越大和顏色越深,說明此節(jié)點對應(yīng)的相關(guān)靶點越重要。以邊表示兩個靶點之間的關(guān)聯(lián)性,邊越粗,靶點之間的關(guān)聯(lián)越顯著。通過PPT網(wǎng)絡(luò)圖篩選出前十個蛋白互作圖,如圖3所示,是degree前十的十個蛋白相互作用的靶點圖,3個深色為度值最高的,說明這些青黛靶點在治療2型糖尿病中具有重要作用。圖4即為青黛-成分-靶點的可視化,根據(jù)篩選出的青黛有效成分、青黛和2型糖尿病交集靶點來做圖,三角形代表青黛,六邊形代表青黛有效成分,圓形代表青黛與2型糖尿病的交集靶點。依據(jù)圖示,青黛可能通過這些有效成分作用于靶點蛋白發(fā)揮藥效作用。

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 前十靶點蛋白互作圖

表2 關(guān)鍵靶點top10

2.4 GO生物學(xué)功能富集分析

在David數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入青黛和2型糖尿病的交集基因204個,選擇其中 GO生物過程(biological process,BP),生物學(xué)功能富集分析共得到生物學(xué)富集結(jié)果 950條,將其中前20條生物過程富集以氣泡圖的形式展現(xiàn)(圖5),其中前3位的富集過程包括:RNA聚合酶II前驅(qū)體轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promotor)、藥物反應(yīng)(response to drug)、基因表達(dá)的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression),分析顯示青黛改善糖尿病可能發(fā)生發(fā)展在RNA聚合酶II前驅(qū)體轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控等過程。

圖5 GO生物學(xué)功能富集結(jié)果氣泡圖

2.5 KEGG通路分析

在David數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入青黛和2型糖尿病的交集基因204個,選擇KEGG信號通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析,得到信號通路 188條,前20條通路進(jìn)行展示(圖6),其中前3條通路包括:癌癥通路類(pathways in cancer)、 糖尿病并發(fā)癥中的AGR-GAGE信號通路(AGR-GAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化乙型肝炎(Lipid and atherosclerosis Hepatitis B),這些通路大多與JUN、STAT3、MAPK3蛋白有關(guān)。

圖6 KEGG富集結(jié)果氣泡圖

2.6 分子對接結(jié)果

根據(jù)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖和表2的結(jié)果選擇了度值排名前三的3個蛋白,將蛋白與青黛活性成分進(jìn)行對接,以Total Score≥5為篩選條件[15],驗證有效成分與關(guān)鍵蛋白之間是否有穩(wěn)定的結(jié)合,結(jié)合越緊密,藥效越好。以總打分值大于5為標(biāo)準(zhǔn)[15],篩選出對接結(jié)果較好的化學(xué)成分,將分子與蛋白的結(jié)合可視化(圖7)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3),MAPK3與異靛藍(lán)(Isoindigo)的結(jié)合力不強(qiáng),關(guān)鍵靶點蛋白STAT3、JUN與有效成分雙靛藍(lán)(bisindigotin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、異牡荊素(Isovitexin)有較強(qiáng)的結(jié)合,這些化合物在抗2型糖尿病中可能發(fā)揮著重要作用。

圖7 分子對接可視化

表3 分子對接結(jié)果

3 討論

2型糖尿病主要表現(xiàn)為三多一少:多飲、多食、多尿,體重減少。糖尿病是一種慢性疾病,其病因復(fù)雜,靶點多,且中藥的有效成分也是多成分、多靶點共同作用,在驗證機(jī)制的過程中將青黛采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式篩選出活性成分進(jìn)行驗證。

青黛篩選出有效成分9個,青黛與2型糖尿病的交集基因共有204個,通過蛋白互作篩選出10個關(guān)鍵蛋白中的前三蛋白與有效成分結(jié)合,其中3個有效成分雙靛藍(lán)(bisindigotin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、異牡荊素(Isovitexin)與STAT3和JUN結(jié)合較強(qiáng)。GO富集分析發(fā)現(xiàn),最顯著的是RNA聚合酶II前驅(qū)體轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控過程,此過程涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等產(chǎn)生的炎癥因子會加劇細(xì)胞黏附,產(chǎn)生胰島素抵抗,在T2DM過程RNA聚合酶II前驅(qū)體轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控表達(dá)會上調(diào)DEGs[16],是可能發(fā)揮抗2型糖尿病的生物過程,KEGG通路富集分析糖尿病最可能發(fā)生的通路是癌癥類通路,其中T2DM與癌癥類PI3K-AKT信號通路[17]有關(guān),發(fā)現(xiàn)通路上的mTOR水平在癌癥和T2DM上表達(dá)上調(diào),在胰島組織中表達(dá)下調(diào),說明T2DM和癌癥激活了PI3K-AKT通路上的相關(guān)蛋白,則治療T2DM要抑制通路上的蛋白,同時癌癥類通路中的JNK信號通路和STAT3信號通路也可能發(fā)揮了治療2型糖尿病的作用。然而青黛還能夠抑制人結(jié)腸細(xì)胞炎癥模型的促炎因子IL-6的表達(dá)而促進(jìn)抑炎因子IL-10的表達(dá)[18]。在青黛與2型糖尿病的共有靶點中篩選出綜合評分的前三個蛋白:STAT3、JUN、MAPK3。其中STAT3是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子,其介導(dǎo)細(xì)胞對白介素和其他生長因子的反應(yīng),也可以與急性期蛋白啟動子IL-6結(jié)合,STAT3還參與調(diào)控多種細(xì)胞凋亡抑制基因的表達(dá)。因為胞漿內(nèi)的巨噬細(xì)胞STAT3能刺激白介素-10的分泌,能誘導(dǎo)某些炎癥性疾病的發(fā)生[19]。JNK信號通路一旦被激活會由胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮作用且JNK信號通路與糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病周圍神經(jīng)病變等都有緊密聯(lián)系[20]。c-jun氨基末端激酶(c-jun,N-terminal kinase JNK)能調(diào)節(jié)炎癥、凋亡和自噬等過程,且JNK信號通路在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[21]。JNK能減輕胰島素抵抗和β細(xì)胞損害,因此可以作為治療糖尿病的潛在目標(biāo),JNK表達(dá)下調(diào)后,小鼠血糖水平明顯降低并且胰島素的敏感性提高[22]。MAPK3是一種蛋白編碼基因且家族成員眾多,有JNK、p38MAPK等。因為MAPK3和MAPK1在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上有85%的相似,所以兩者生理功能也相同,故經(jīng)常把MAPK1/3或者ERK1/2合稱。但是MAPK3的整體磷酸化水平低于MAPK1,能夠誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化形成肥胖[23]。

本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接為基礎(chǔ)闡釋了青黛初步可能防治2型糖尿病的作用蛋白靶點、有效成分及通路,為進(jìn)一步探究青黛防治2型糖尿病的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。