董雨蓉，解存，劉暢，趙佳，王朔

（1.天津醫(yī)科大學(xué)胸科臨床學(xué)院，天津 300070；2.天津大學(xué)胸科醫(yī)院急診科，天津 300222；3.天津市心血管危重癥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300222；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；5.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

動(dòng)物疾病模型是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中不可或缺的工具，其制備方法是模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)制，或通過(guò)模擬致病因素，造成典型或類似的病理狀態(tài)，建立與人類疾病相應(yīng)的動(dòng)物模型[1]。建立合適的動(dòng)物模型不僅能推進(jìn)對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且可以為臨床診療方式的改進(jìn)及新藥研發(fā)提供重要平臺(tái)[2]。近年來(lái)，中醫(yī)藥將“病證結(jié)合”“方證對(duì)應(yīng)”的臨床診療方法引入動(dòng)物模型的構(gòu)建上，為深入探究中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)臨床辨證客觀化、規(guī)范化，挖掘并創(chuàng)新中醫(yī)理論提供了新的思路與方法。病證動(dòng)物模型是在西醫(yī)動(dòng)物疾病模型制備方法的基礎(chǔ)上，模擬臨床辨病辨證的方法，通過(guò)加入中醫(yī)干預(yù)因素，建立具有中醫(yī)特色的動(dòng)物模型[3]。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦桥R床中致死率、致殘率較高的心腦血管疾病，《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2021》顯示，目前中國(guó)冠心病患病人數(shù)約為1 139 萬(wàn)，近20 年來(lái)中國(guó)冠心病的發(fā)病率增幅較大，上升20.6%，心臟病城鄉(xiāng)病死率分別高達(dá)148.51/10 萬(wàn)、164.66/10 萬(wàn)，成為中國(guó)僅次于腦血管病的第二大疾病死亡原因[4]。中醫(yī)將冠心病歸于“胸痹、心痛”“真心痛”等范疇，認(rèn)為本病往往與氣滯、血瘀、痰濁、寒凝等實(shí)邪及氣虛、陰虛、陽(yáng)虛等虛損病理因素相關(guān)，具有本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的病理性質(zhì)，故衍生出多種中醫(yī)證型的冠心病。目前，對(duì)于冠心病中醫(yī)證型動(dòng)物模型制備方法種類多樣，但存在與臨床病證相關(guān)性不強(qiáng)、穩(wěn)定性較差、主客觀指標(biāo)不夠明確、病理機(jī)制不夠明晰等問(wèn)題，因此文章通過(guò)對(duì)冠心病常用動(dòng)物模型制備方法整理歸納，對(duì)冠心病中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建立展開(kāi)思考。

1 冠心病常用動(dòng)物模型的制備方法

冠心病動(dòng)物模型常用的動(dòng)物有大鼠、小鼠、小型豬、兔、犬等，其選取主要以動(dòng)物生理結(jié)構(gòu)和功能與人的相似程度、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)的可操作性等為依據(jù)[5]。如大鼠及小鼠具有體積小、易于繁殖和飼養(yǎng)、操作性強(qiáng)、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，運(yùn)用最為廣泛；小型豬的生理解剖和血液生化指標(biāo)與人類接近，且因體積較大，可通過(guò)中獸醫(yī)學(xué)“四診”方法直觀觀測(cè)并掌握其癥狀與病情；犬的心血管功能與人相似，但主要用于毒理研究；兔對(duì)于高脂飲食極為敏感，容易復(fù)制高脂血癥模型[6]。見(jiàn)表1。

表1 冠心病常用動(dòng)物模型的制備方法匯總Tab.1 Summary of preparation methods of common animal models of CHD

1.1 手術(shù)損傷法

1.1.1 開(kāi)胸手術(shù)造模 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)是最常用的方法。該方法是通過(guò)對(duì)麻醉狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物冠狀動(dòng)脈分離處結(jié)扎，造成心肌局部缺血或壞死，復(fù)制臨床中類似心肌梗死的動(dòng)物模型[7]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)心臟解剖結(jié)構(gòu)的不同，結(jié)扎部位有所差異，如大鼠一般在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，即冠狀動(dòng)脈左前降支（LAD）部位結(jié)扎；小型豬在LAD 中下1/3 部位結(jié)扎；犬在LAD 第1 對(duì)角支部位結(jié)扎；兔在LAD第1、2 對(duì)角支部位結(jié)扎。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，若ST段（ST-segment）抬高且結(jié)扎部位以下顏色發(fā)紺、搏動(dòng)減弱為建模成功的標(biāo)志。該方法阻塞冠狀動(dòng)脈分支對(duì)血管損傷較大，動(dòng)物死亡率相對(duì)較高，因此手術(shù)時(shí)可滴注硝酸甘油預(yù)防血管痙攣，或噴灑利多卡因降低心臟對(duì)手術(shù)的反應(yīng)刺激，同時(shí)密切關(guān)注動(dòng)物心律及呼吸狀態(tài)，及時(shí)進(jìn)行搶救。

冠狀動(dòng)脈夾閉法原理與結(jié)扎法類似，是將分離出的冠狀動(dòng)脈通過(guò)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾鉗進(jìn)行阻斷，具有創(chuàng)傷小，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，主要用于心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型的制備[8]。由于對(duì)操作者分離冠狀動(dòng)脈的技術(shù)手法要求較高，沒(méi)有結(jié)扎法運(yùn)用廣泛。

冠狀動(dòng)脈壓迫法使用氣囊梗阻器或水囊縮窄器固定于冠狀動(dòng)脈表面，通過(guò)控制球囊改變冠狀動(dòng)脈的血流流量，造成血液循環(huán)障礙，從而構(gòu)建心肌缺血模型[9]。這種方法可控性強(qiáng)，可以模擬冠狀動(dòng)脈不完全狹窄和完全性狹窄的心肌缺血狀態(tài)[10]。

吸水性的塑料環(huán)（Ameroid）縮窄法是在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下開(kāi)胸，將具有吸水性的Ameroid 環(huán)套在LAD 上，在閉合胸腔后，Ameroid 環(huán)塑料層會(huì)吸水膨脹，但由于其外層為金屬構(gòu)造，膨脹的塑料層只能逐漸向內(nèi)擠壓血管，造成慢性心肌缺血損傷[11]。該方法主要用于小型豬、犬等大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物慢性心肌缺血模型的制備。

1.1.2 閉胸手術(shù)造模 閉胸手術(shù)法借助于臨床中微創(chuàng)介入原理，一般是通過(guò)分離的頸總動(dòng)脈將堵塞物（血栓栓塞或球囊）送入冠狀動(dòng)脈內(nèi)造成血流終止[12]。該方法主要用于小型豬、犬等大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有創(chuàng)傷小、動(dòng)物成活率高的特點(diǎn)。但對(duì)操作者技術(shù)手法、操作經(jīng)驗(yàn)要求較高，且由于不同動(dòng)物可能存在較大的體積差異，堵塞物大小不一，易造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差。

內(nèi)膜損傷法是將球囊通過(guò)預(yù)置導(dǎo)管經(jīng)頸總動(dòng)脈進(jìn)入冠狀動(dòng)脈，利用球囊機(jī)械性抽動(dòng)導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增殖，造成管壁增厚管腔狹窄，模擬臨床冠心病患者心肌缺血狀態(tài)。該方法常用于小型豬心肌缺血模型的制備[13]。

微電流刺激法是用電極導(dǎo)管置于LAD 處釋放微電流，刺激冠狀動(dòng)脈血管外膜使之受損，經(jīng)生理性止血過(guò)程產(chǎn)生血栓或血管閉塞[14]。該方法操作損傷小，可以模擬急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)生后產(chǎn)生的瘢痕組織。

1.2 藥物造模

1.2.1 腦垂體后葉素（Pit）誘導(dǎo)法 Pit 的藥物機(jī)制是大劑量注射致可使血栓烷A2 （TXA2）/前列環(huán)素（PGI2）異常，從而全身小血管收縮、冠狀動(dòng)脈痙攣，外周負(fù)荷增大，心肌耗氧增加從而導(dǎo)致心肌缺血[15]。此方法操作簡(jiǎn)便，且與冠心病心絞痛急性發(fā)作時(shí)的狀態(tài)相近。大鼠一般可采取皮下注射、腹腔注射、舌下靜脈推注等方式，兔采用耳緣靜脈注射的方式進(jìn)行模型的制備。

1.2.2 異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)法 連續(xù)注射ISO至動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)激動(dòng)心臟β1 受體使心率加快，心肌收縮力增強(qiáng)，心肌耗氧量增大，導(dǎo)致氧供需失衡，造成心肌缺血損傷[16]。同時(shí)激動(dòng)β2 受體使全身骨骼肌血管舒張，冠狀動(dòng)脈血管舒張，由于靜脈給藥舒張壓明顯下降，冠狀動(dòng)脈血流減少，加重心肌缺血狀態(tài)。大鼠、小鼠可采用腹腔注射方式，兔采用耳緣靜脈注射或腹腔注射方式進(jìn)行模型的制備。

1.2.3 阿霉素（Dox）誘導(dǎo)法 將生理鹽水配置的Dox 溶液連續(xù)注射至動(dòng)物體內(nèi)，刺激神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，造成心臟毒性，表現(xiàn)為心功能下降，即可說(shuō)明心肌缺血[17]。大鼠、小鼠可采用尾靜脈注射或腹腔注射方式進(jìn)行模型的制備。

1.3 飲食誘導(dǎo)造模

1.3.1 高脂飲食 高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)法通過(guò)喂養(yǎng)動(dòng)物高脂飼料，使其機(jī)體發(fā)生脂代謝紊亂，動(dòng)脈形成粥樣硬化性斑塊，并表現(xiàn)出心功能損傷的癥狀，即可說(shuō)明心肌缺血[18]。該法主要適用于基因缺陷型小鼠心肌缺血模型的制備，如載脂蛋白E 缺陷（ApoE-/-）小鼠、低密度脂蛋白受體（LDL-R）缺陷小鼠等[19]。

1.3.2 維生素D3（VD3） VD3是鈣離子誘導(dǎo)劑，通過(guò)大量的VD3灌胃，機(jī)體血鈣升高，促使鈣鹽在動(dòng)脈內(nèi)膜中沉積，平滑肌細(xì)胞鈣化或變性，血漿內(nèi)脂質(zhì)對(duì)動(dòng)脈管壁發(fā)生侵蝕和損傷，從而建立冠狀動(dòng)脈粥樣硬化模型[20]。

1.4 其他

1.4.1 運(yùn)動(dòng)負(fù)荷法 采用強(qiáng)迫跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的方法，并采用聲音、小木棍敲打、電擊等刺激，使大鼠保持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度至力竭，以大鼠下跑臺(tái)后腹部著地、四肢癱軟、翻正反射暫時(shí)消失作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。力竭性運(yùn)動(dòng)使心臟處于高負(fù)荷狀態(tài)，需氧量明顯增加，導(dǎo)致心肌組織缺血缺氧，從而心電圖呈現(xiàn)缺血性改變、心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并且心血管活性物質(zhì)失衡加重心肌損傷[21]。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 最常用的小鼠模型是ApoE 聯(lián)合LDL-R 基因敲除。ApoE 缺乏會(huì)使脂質(zhì)代謝紊亂，且LDL-R 基因缺失影響低密度脂蛋白的降解，從而脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)皮產(chǎn)生粥樣斑塊[22-23]。在ApoE 和神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOSα）雙基因敲除動(dòng)物中，nNOSα 具有在血管受損后抑制內(nèi)膜增生，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其遺傳缺失則加速了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

目前制備冠心病動(dòng)物模型的方法較為成熟，結(jié)合造模后動(dòng)物的一般情況、生化指標(biāo)、心電圖表現(xiàn)及病理指標(biāo)，來(lái)模擬臨床癥狀和體征，選擇制備具有相應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡墓谛牟?dòng)物模型。一般來(lái)講，手術(shù)法具有創(chuàng)傷大、程度重的特點(diǎn)，更加偏于模擬急性心肌缺血狀態(tài)，藥物及飲食法造模周期相對(duì)較長(zhǎng)，用于模擬創(chuàng)傷程度相對(duì)較輕的慢性心肌缺血狀態(tài)。冠心病結(jié)合中醫(yī)證型模型的制備是當(dāng)下研究熱點(diǎn)，目前模型多在西醫(yī)病因病理基礎(chǔ)之上，結(jié)合中醫(yī)對(duì)冠心病即“胸痹心痛”病機(jī)理論，而建立的病證結(jié)合動(dòng)物模型。

2 冠心病中醫(yī)證候動(dòng)物模型的制備方法

根據(jù)《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》教材及《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》，總結(jié)并列舉常見(jiàn)冠心病中醫(yī)證候動(dòng)物模型，主要包括血瘀證（心血瘀阻證）、氣虛血瘀證、氣陰兩虛證、痰瘀互結(jié)證、脾虛痰濁證、寒凝血瘀證等[3，24]。見(jiàn)表2。

表2 冠心病中醫(yī)證候動(dòng)物模型制備與評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab.2 Preparation and evaluation index of animal model of traditional Chinese medicine syndrome of CHD

2.1 血瘀證動(dòng)物模型 血瘀證是最常見(jiàn)的冠心病中醫(yī)證型，多因血行不暢，凝滯心脈，引起心胸刺痛，可見(jiàn)胸部固定性痛，舌質(zhì)或舌體紫暗且有瘀斑瘀點(diǎn)，舌下靜脈紫暗，口唇紫暗或暗紅。

在大鼠高脂飼料飼養(yǎng)后的第7 日和第14 日分2 次進(jìn)行VD3注射，并在飼養(yǎng)12 周大鼠主動(dòng)脈斑塊形成后，結(jié)扎LAD，以即時(shí)Ⅱ?qū)?lián)心電圖所示ST 段弓背抬高，肉眼所見(jiàn)結(jié)扎部位以下心肌蒼白作為判斷模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)，并以養(yǎng)心通脈方作為“以方測(cè)證”的藥物反證模型建立[25]。有學(xué)者采用高脂飼料喂養(yǎng)、VD3灌胃復(fù)合皮下多點(diǎn)注射ISO 方法造成實(shí)驗(yàn)大鼠心肌缺血，模擬心脈痹阻的情況，觀察心電圖J 點(diǎn)及ST 段的改變程度證實(shí)模型建立，并通過(guò)觀察其代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)血瘀證的特異性標(biāo)志物[26-29]。藺瑞等[30]采用Ameriod 縮窄環(huán)置入術(shù)建立模型，在第8 周時(shí)通過(guò)冠狀動(dòng)脈造影提示冠狀動(dòng)脈狹窄程度達(dá)99%，結(jié)合血脂、凝血、血流變指標(biāo)升高，提示冠心病處于血瘀狀態(tài)，證明模型建立成功。以上方法均可在一定程度上造成單純或復(fù)合的冠狀動(dòng)脈血流速度減緩、內(nèi)皮損傷或血液流變學(xué)改變，模擬臨床中血瘀證的表現(xiàn)。

2.2 氣虛血瘀證動(dòng)物模型 氣虛血瘀證是常見(jiàn)的虛實(shí)夾雜復(fù)合證型，多因氣虛無(wú)力或血行瘀滯互為因果，引起心陽(yáng)不振，瘀阻心脈之癥，常有胸悶心悸，心痛如刺，精神疲憊，舌色暗淡或有斑點(diǎn)等臨床表現(xiàn)，一般采用模擬“氣虛+血瘀”的聯(lián)合誘導(dǎo)方式制備模型。

采用LAD 結(jié)扎復(fù)合強(qiáng)迫跑步的方法模擬“氣虛血瘀”狀態(tài)，結(jié)合臨床辨證依據(jù)，觀察模型大鼠主癥、兼癥，將胸痛胸悶、心悸氣短主癥量化為心臟功能和呼吸幅度具體指標(biāo)，身倦乏力、面色紫暗兼癥量化為空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)指標(biāo)、力竭運(yùn)動(dòng)和舌底紅-綠-藍(lán)-色彩模式（RGB）值，并采集舌象RGB 值及脈搏幅度，以雙參通冠方進(jìn)行干預(yù)，全面觀測(cè)上述證型表征，證明模型建立成功[31]。復(fù)合控制飲食、疲勞運(yùn)動(dòng)及冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的方法建立冠心病氣虛血瘀證大鼠模型，以心電圖ST 段弓背抬高、舌色RGB 值改變、舌頭蘇木精-伊紅（HE）染色法及PGI2、TXA2 的變化作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從西醫(yī)病理機(jī)制、中醫(yī)辨證理論及微觀生化指標(biāo)方面證明該模型的成立[32]。采用游泳、高脂飼料饑餓飼養(yǎng)聯(lián)合Pit 腹腔注射的方法建立的小鼠模型，通過(guò)中醫(yī)證候評(píng)分量化氣虛血瘀“證”的特征，觀測(cè)心電圖示T 波低平或倒置聯(lián)合心率增快、血液黏稠微觀指標(biāo)模擬冠心病“病”的特征，以此評(píng)價(jià)“病證結(jié)合”的冠心病氣虛血瘀證小鼠模型[33]。以上方法在“血瘀證”的基礎(chǔ)上，從干預(yù)因素（疲勞運(yùn)動(dòng)、飲食控制）到癥狀表現(xiàn)（倦怠乏力、證候評(píng)分）再到理化客觀指標(biāo)復(fù)合臨床“氣虛證”的表現(xiàn)，更加貼合臨床氣虛血瘀證的發(fā)病機(jī)制及癥狀表現(xiàn)。

2.3 氣陰兩虛證動(dòng)物模型 氣陰兩虛證是冠心病中后期常見(jiàn)的證型，多因心氣虛損并見(jiàn)陰血不足，引起心神失養(yǎng)，心胸隱痛，表現(xiàn)為胸部隱痛或悶痛、神疲力乏、煩躁不安、舌紅苔少或舌淡胖有齒痕。

采用小型豬為研究對(duì)象，通過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（PTCA） 球囊擴(kuò)張導(dǎo)管阻塞LAD 血流，造成冠心病心肌缺血狀態(tài)，其中心肌損傷致使心臟結(jié)構(gòu)和功能表征指標(biāo)下降，以及舌脈評(píng)分的變化均提示氣陰兩虛證病理及體征的改變，并以通脈養(yǎng)心丸和生脈膠囊干預(yù)，驗(yàn)證該模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的可靠性[34]。該模型用球囊加壓阻斷血流供應(yīng)，并采用“以方測(cè)證”的方法結(jié)合客觀指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)研究氣陰兩虛證具有指導(dǎo)作用，但該證在臨床中多為冠心病久病或老齡人群，因此制備模型時(shí)間較長(zhǎng)。

2.4 痰瘀互結(jié)證動(dòng)物模型 痰瘀互結(jié)證是隨著現(xiàn)代疾病譜改變逐漸增多的一類復(fù)雜證型，多因脾虛生痰，氣血瘀滯，相互搏結(jié)，引發(fā)心脈損傷，表現(xiàn)為胸部悶痛、唇舌青紫的“血瘀”，并見(jiàn)頭昏乏力、身體肥胖、大便黏膩、舌苔肥膩、毛發(fā)油膩的“痰濁”癥狀。

陳潔等[35]用高脂高糖飼料喂養(yǎng)復(fù)合腹腔注射VD3建立痰瘀互結(jié)證大鼠模型，以大鼠造模后出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡少動(dòng)、反應(yīng)遲緩，血脂檢查見(jiàn)三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高，胸主動(dòng)脈解剖見(jiàn)不穩(wěn)定的粥樣斑塊提示造模成功。潘永明等[36]用長(zhǎng)期高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)合注射VD3+ISO 的方法建立模型，觀察小型豬下腹部出現(xiàn)紅色瘀斑、耳部瘀紫、喘息加快、趴伏煩躁或不動(dòng)等心肌缺血的體征，舌苔厚膩、舌色紫暗、毛發(fā)油膩無(wú)光澤等情況來(lái)判定“痰瘀互結(jié)證”模型是否成功建立。李磊等[37]在高脂飼料喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，在冠狀動(dòng)脈造影后將球囊送入LAD 并進(jìn)行拉動(dòng)，造成冠狀動(dòng)脈損傷，模擬痰濁與血瘀并見(jiàn)的狀態(tài)，檢測(cè)血脂、血流變改變情況。使用小動(dòng)物超聲觀察心功能變化，采集中醫(yī)證候評(píng)分信息，綜合評(píng)估冠心病痰瘀互結(jié)證小型豬模型的建立情況[37-38]。

課題組對(duì)比高脂飼料聯(lián)合手術(shù)、藥物造模的方法，發(fā)現(xiàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合LAD 結(jié)扎術(shù)的方法，模擬“由痰致瘀、痰瘀互結(jié)”的病理變化來(lái)制備痰瘀互結(jié)證大鼠、小鼠模型，具有穩(wěn)定性好、成模率高、可復(fù)制性強(qiáng)的特點(diǎn)[39-40]。以造模后血脂異常、HE染色脂肪細(xì)胞沉積作為“痰濁”的病理表現(xiàn)，以心功能降低、心肌纖維化作為“瘀血”的病理表現(xiàn)，并觀察一般情況，檢測(cè)血流變、心肌酶、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）指標(biāo)改變及機(jī)制通路相關(guān)指標(biāo)變化作為輔助提示該證型建立的參考依據(jù)[41-44]。通過(guò)丹蔞片干預(yù)冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠模型，發(fā)現(xiàn)相關(guān)藥理學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)及代謝產(chǎn)物均有顯著回調(diào)，進(jìn)一步反證“病證結(jié)合”指導(dǎo)下痰瘀互結(jié)證模型的可靠性及實(shí)用性[45]。

2.5 脾虛痰濁證動(dòng)物模型 因過(guò)食肥甘，脾失健運(yùn)，聚生濕痰，久聚不散可損傷脈道，形成動(dòng)脈粥樣斑塊，瘀塞心脈，表現(xiàn)為胸悶胸痛、胃脘痞滿、肢體沉重、面色無(wú)華、納呆、倦怠，多采用高脂飲食喂養(yǎng)制備模型。

在高脂飼料喂小型豬24 周后，觀察發(fā)現(xiàn)小型豬出現(xiàn)類似于痰濁證的臨床癥狀，如形體肥胖、毛發(fā)干枯及神志淡漠、舌色淡白、嗜睡懶惰的表現(xiàn)，進(jìn)一步檢測(cè)血清及心臟組織的血脂及生化指標(biāo)水平，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)水平及內(nèi)皮功能均出現(xiàn)明顯損傷，提示脾虛痰濁證小型豬模型建立成功[46]。采用高脂飼料喂養(yǎng)及腹腔注射VD3建立大鼠模型，通過(guò)觀察大鼠一般情況及主動(dòng)脈病理學(xué)染色，檢測(cè)血脂及炎癥、內(nèi)皮損傷指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)該模型出現(xiàn)粥樣斑塊沉積、脂質(zhì)過(guò)氧化表現(xiàn)，符合脾虛痰濁證的病理變化[47]。用隔日游泳、高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備冠心病“脾虛生痰”型小型豬模型，心肌細(xì)胞病理學(xué)及缺血區(qū)超微結(jié)構(gòu)顯示心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，線粒體腫脹，炎性因子蛋白及信使RNA（mRNA）表達(dá)明顯增高，提示痰濁內(nèi)生加劇心臟損傷[48]。該模型主要仍以高脂飼料喂養(yǎng)模擬痰濁壅盛的病理性質(zhì)，復(fù)合微觀指標(biāo)提示心臟損傷，從而制備脾虛痰濁的動(dòng)物模型。

2.6 寒凝血瘀證動(dòng)物模型 寒凝血瘀證也是臨床常見(jiàn)的冠心病證型，多因陰寒凝滯，閉阻陽(yáng)氣，發(fā)為驟然心痛，表現(xiàn)為胸痛遇寒而發(fā)或猝然心痛、面色蒼白、畏寒肢冷、舌色紫暗癥狀。

通過(guò)將大鼠間斷反復(fù)冷刺激將大鼠置于寒冷/復(fù)溫的環(huán)境，模擬寒邪凝滯的病機(jī)，加之Pit 注射造成心肌缺血的血瘀病機(jī)，構(gòu)建寒凝血瘀證的動(dòng)物模型，將宏觀表征（體溫下降、唇周爪子黏膜顏色變淺、心率降低等）和微觀指標(biāo)[微靜脈收縮、血液流速減慢、血漿TXB2、大鼠6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）值升高等]作為寒凝血瘀證大鼠模型建立的診斷標(biāo)準(zhǔn)[49]。該造模方法通過(guò)寒冷刺激的方式模擬因寒致病的病理機(jī)制，聯(lián)合理化指標(biāo)反映血管痙攣、血流變改變、心肌微循環(huán)障礙等血瘀病理性質(zhì)，但存在無(wú)法模擬臨床猝然胸痛的客觀表現(xiàn)等問(wèn)題。

上述方法是目前制備冠心病病證結(jié)合模型最為常見(jiàn)的，多是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，西醫(yī)病理模型復(fù)合多因素模擬中醫(yī)病因病機(jī)建立證候模型，主要通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般情況，結(jié)合相關(guān)生化指標(biāo)建立證候模型，一定程度上體現(xiàn)出中醫(yī)病證結(jié)合的特色，可與中醫(yī)臨床辨治相對(duì)應(yīng)。

3 討論

3.1 中醫(yī)與西醫(yī)對(duì)冠心病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的比較 冠心病動(dòng)物模型的制備是模擬人類冠心病病因病機(jī)所致的病理狀態(tài)，其基礎(chǔ)仍以西醫(yī)病理學(xué)為基礎(chǔ)，是連接基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的重要工具。西醫(yī)冠心病動(dòng)物模型多施加單一物理、化學(xué)、生物手段，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織器官損傷，模擬冠心病發(fā)展某一階段典型或類似的病理狀態(tài)，具有操作簡(jiǎn)便、模型穩(wěn)定、公認(rèn)度較高的特點(diǎn)[50]。而中醫(yī)冠心病動(dòng)物模型則是結(jié)合中醫(yī)辨證論治原則，多采用西醫(yī)病理模型復(fù)合中醫(yī)病因病機(jī)的造模方法，更具中醫(yī)藥病證結(jié)合研究特色，更貼合中醫(yī)認(rèn)識(shí)冠心病的角度和思路，但普遍來(lái)講，中醫(yī)冠心病動(dòng)物模型制備及評(píng)價(jià)方法尚未形成研究領(lǐng)域統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此推廣度較差、公認(rèn)度較低[51]。

3.2 病證結(jié)合動(dòng)物模型制備的實(shí)踐與認(rèn)識(shí) 以冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠、小鼠模型建立為例，課題組依據(jù)“脾虛生痰，心脈瘀阻，終致痰瘀搏結(jié)”的病機(jī)演變規(guī)律模擬建立動(dòng)物模型，參照臨床獲得的客觀化、特異性指標(biāo)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上進(jìn)行佐證，并進(jìn)行方證對(duì)應(yīng)的相關(guān)研究，形成了較為系統(tǒng)的冠心病痰瘀互結(jié)證病證結(jié)合研究思路，總結(jié)以下幾個(gè)特點(diǎn)。

3.2.1 病證結(jié)合，反映中醫(yī)辨證思路及特色 西醫(yī)認(rèn)為冠心病的病理基礎(chǔ)為各種原因?qū)е碌男募」┭鹾托柩跏Ш?，造成冠狀?dòng)脈粥樣硬化不斷累積，引起斑塊破裂，導(dǎo)致心臟功能受損，中醫(yī)將其歸因于瘀血痹阻心脈，并認(rèn)為脾虛導(dǎo)致的痰濁內(nèi)生，是冠心病發(fā)生的始動(dòng)因素[52]?；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，在模型制備時(shí)，先采用高脂飲食的方式進(jìn)行喂養(yǎng)，模擬“痰濁”的病理狀態(tài)，并采用結(jié)扎的方法阻斷冠狀動(dòng)脈血流，模擬西醫(yī)心肌缺血的病理狀態(tài)，即中醫(yī)的“血瘀”病理性質(zhì)，并通過(guò)指標(biāo)檢測(cè)證明復(fù)合的證候模型病變程度重于單一證候模型，并與臨床癥狀相吻合，即判定為“痰瘀互結(jié)”模型制備成功。

3.2.2 方證對(duì)應(yīng)，反證動(dòng)物模型的穩(wěn)定性 丹蔞方作為治療冠心病痰瘀互結(jié)證臨床的辨治用藥，在“以方測(cè)證”原則指導(dǎo)下，分別給予冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠、小鼠灌胃干預(yù)，通過(guò)觀測(cè)模型建立和評(píng)價(jià)相關(guān)指標(biāo)的改善，反證該模型的可靠性、穩(wěn)定性和科學(xué)性。此外，通過(guò)將臨床研究獲得的證型特異性指標(biāo)，如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、血管緊張素Ⅱ（Ang-Ⅱ）等在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面進(jìn)行驗(yàn)證，并觀察動(dòng)物有臨床患者的類似體征（一般情況、舌紫暗等），形成結(jié)合宏觀表征與微觀辨證的研究方法，進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可信度，明確該模型在病理層面的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥“病-證-方”對(duì)應(yīng)研究提供研究方向。

3.2.3 中西匯通，融合現(xiàn)代生物分析技術(shù) 采用系統(tǒng)生物學(xué)及藥物化學(xué)分析技術(shù)，將組學(xué)分析手段引入冠心病痰瘀互結(jié)證分子水平領(lǐng)域的探索研究，找到其特異性組學(xué)生物標(biāo)志物，也為揭示冠心病痰瘀互結(jié)證的證候規(guī)律及意義提供依據(jù)。課題組采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF/MS）檢測(cè)經(jīng)丹蔞片干預(yù)后冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠血清中代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)亞油酸、γ-亞麻酸和溶血磷脂酰膽堿出現(xiàn)明顯回調(diào)變化，也可作為冠心病痰瘀互結(jié)證微觀辨證的代謝生物標(biāo)志物，為中醫(yī)證候的研究提供研究思路。

3.3 不足與展望 目前，病證結(jié)合的冠心病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備方法已成為中醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)中醫(yī)病因病機(jī)探索、證候類型比較、中藥新藥開(kāi)發(fā)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等基礎(chǔ)研究的重要工具和手段，一定程度上推動(dòng)了中醫(yī)藥科研的客觀化、現(xiàn)代化。就動(dòng)物模型本身而言，現(xiàn)有的制備方法不可能完全模擬人類冠心病動(dòng)脈斑塊破裂引起的血管內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致心臟功能受損的致病機(jī)制，只是反映某一病理階段的具體表現(xiàn)，主要通過(guò)動(dòng)物生化指標(biāo)結(jié)果提示具有類似的病理機(jī)制。加之中醫(yī)辨證所創(chuàng)造的復(fù)合模型，僅是從中醫(yī)理論角度出發(fā)，對(duì)中醫(yī)臨床實(shí)際進(jìn)行了模擬，且未形成公認(rèn)的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和研究路徑，故部分學(xué)者對(duì)病證結(jié)合模型持有懷疑或否認(rèn)的態(tài)度[53]。此外，中醫(yī)診斷主要通過(guò)望、聞、問(wèn)、切4 個(gè)方面獲取診斷信息，然而其中的“問(wèn)”詢問(wèn)患者的主觀感受以及“切”切脈來(lái)判斷陰陽(yáng)表里、寒熱虛實(shí)等相關(guān)情況無(wú)法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上實(shí)現(xiàn)，這是無(wú)法跨越的壁壘，且對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活狀態(tài)、飲食情況、身體狀況等變化情況的客觀化標(biāo)準(zhǔn)，冠心病病證結(jié)合動(dòng)物模型的發(fā)展之路仍需要不斷探索和完善[54]。