張露丹，孫艷君，劉凡琪，張垚，高晟瑋，陳希西，呂春曉，黃宇虹

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院臨床藥理中心，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院治未病健康管理中心，天津 300381；4.青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院心臟中心，青島 266000）

心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的嚴重和終末階段，最新流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，中國35 歲以上居民心力衰竭患病率達1.3%，現(xiàn)有心力衰竭患者約890 萬，故早期診斷對心力衰竭意義重大[1-2]。心力衰竭的診斷基于患者臨床癥狀、生物標志物得以實現(xiàn)，其中生物標志物對心力衰竭的診斷尤為重要。中醫(yī)認為心力衰竭病機大多屬于本虛標實，本虛以氣虛為主，兼以陽虛、陰虛；標實以血瘀為主，兼以水飲、痰濁[3]。心氣、心陽不足，氣虛不能行血，陽虛無以溫通血脈，致使心脈瘀阻，日久脾腎陽虛，無以化氣行水，導致水氣凌心，甚至心陽欲脫，或出現(xiàn)氣陰兩虛—氣虛血瘀—陽虛水泛病機變化過程。而氣虛血瘀貫穿本病的全過程，為本病重要的病理基礎[4-5]。文章綜合近15 年文獻，對心力衰竭氣虛血瘀證生物學標志物進行分類總結(jié)，總結(jié)了常見生化標志物、多組學標志物在心力衰竭氣虛血瘀證病證診斷、預后方面的研究現(xiàn)狀，并分析其特征，以期為心力衰竭氣虛血瘀證診斷及治療提供輔助依據(jù)。

1 心力衰竭氣虛血瘀證相關常見生化標志物研究

1.1 B 型利鈉肽（BNP）、N 末端B 型利鈉肽原（NTproBNP） BNP 和NT-proBNP 是慢性心力衰竭診斷和評估預后的“金指標”，是相對理想的心力衰竭生物標志物。心室肌細胞在心室肥厚、心肌炎或纖維化等多種病理條件刺激下產(chǎn)生和釋放有生物活性的BNP 和無活性的NT-proBNP，以應對室壁張力和容量負荷的增加，具有較高的特異性[6-7]。BNP/NT-proBNP 的血漿水平會受很多因素的干擾，年齡、性別、體質(zhì)量、腎功能等因素均會影響其檢測水平，且對NT-proBNP 的影響大于BNP[8]。當其數(shù)值正常時多可排除心力衰竭的診斷，但當其數(shù)值升高時，則需要綜合判定。范倩等[9]將100 例老年慢性心力衰竭患者辨證分為氣陰兩虧、氣虛血瘀、陽虛水泛3 種證型，結(jié)果顯示，NT-proBNP 在3 種證型中呈遞增趨勢，表明BNP/NT-proBNP 與心力衰竭危險程度密切相關，可作為心力衰竭患者中醫(yī)辨證量化指標的參考依據(jù)。

1.2 心肌損傷標志物 心肌肌鈣蛋白（cTn）是反應心肌損傷較理想的標志物，不斷有研究證實cTn 也可用于心力衰竭的預后評估，cTn 動態(tài)升高是心力衰竭預后不良的重要體現(xiàn)[10]。cTn 由肌鈣蛋白T（cTnT）、肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌鈣蛋白C（cTnC）組成，其中cTnT 和cTnI 在心肌細胞受損時釋放入血，其濃度隨心肌細胞損傷的加重而升高，與心力衰竭的病程進展密切相關[6，11]。王路宏[12]研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭氣虛血瘀證患者的cTn 值高于陽虛水泛、氣陰兩虛證，可能是由于心力衰竭氣虛血瘀證的發(fā)生大多和冠心病基礎病史相關，當冠狀動脈微循環(huán)異常發(fā)生時，造成心肌缺氧，引發(fā)心肌細胞損傷，釋放cTn 入血，從而cTn 升高。

1.3 炎癥標志物 炎癥反應與心血管疾病的進展密切相關，炎性介質(zhì)升高是慢性心力衰竭的標志性特征。C 反應蛋白（CRP）是一種急性期反應蛋白，主要由肝臟合成，高水平的CRP 可能會預示心力衰竭風險的增加[13]。研究發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀證CRP 水平高于心肺氣虛證和心氣陰虛兼血瘀證[14]。另有研究表明，CRP 水平隨著心肺氣虛、氣虛血瘀、心脾腎陽虛水泛兼血瘀證逐級演變而升高[15]。提示CRP 水平越高，越容易辨證為血瘀證，為心力衰竭辨證分型提供參考。

1.4 心肌纖維化標志物

1.4.1 可溶性生長刺激表達基因2 蛋白（ST2） ST2是白細胞介素-1 受體家族的成員，存在兩種同工型：一種是可溶型ST2（sST2）；另一種是跨膜型ST2（ST2L）。其中，ST2L 以白細胞介素-33（IL-33）為天然配體[16]。目前研究已證實，IL-33/ST2L 通路是一條心臟保護性信號通路，在抗心肌纖維化、阻止心肌細胞肥大、減少心肌細胞凋亡、改善心功能方面具有重要作用[17]。心臟成纖維細胞受到機械應力刺激后產(chǎn)生釋放IL-33 增多，同時sST2 釋放也增多，sST2 通過與IL-33 競爭性結(jié)合抑制了IL-33/ST2L信號通路的心臟保護作用，并加速了心肌肥大和心肌纖維化[18]。相關研究表明，血漿中sST2 濃度與心力衰竭的癥狀分級呈正相關[19]，sST2 水平在心肺氣虛證、氣虛血瘀證、陽虛水泛證各中醫(yī)證型中呈依次遞增[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，sST2 從心肺氣虛血瘀證到陰竭陽脫證逐級增加，提示sST2 增高聯(lián)合其他指標可為心力衰竭嚴重程度和預后判斷提供依據(jù)。

1.4.2 半乳糖凝集素-3（Gal-3） Gal-3 是一種可溶性的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，在人體內(nèi)其主要由活化的巨噬細胞分泌表達，與心肌成纖維細胞增殖、炎癥和心室重構(gòu)密切相關，可預測心力衰竭的預后[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3 水平在氣陰兩虧證、氣虛血瘀證、陽虛水泛證中依次升高[23]。另有研究顯示，Gal-3 隨著氣虛血瘀、氣陰兩虛血瘀、陽氣虧虛血瘀的發(fā)展而逐級遞增[24]。提示Gal-3 與BNP、cTn 等生物標志物聯(lián)合應用可提高心力衰竭診斷及預后的準確率。

1.4.3 生長分化因子15（GDF-15） GDF-15 是一種應激和炎癥誘導的細胞因子，是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族成員之一[25]。生理條件下，GDF-15在心臟中低表達或幾乎不表達，病理條件下如心肌損傷后，其在心肌細胞中表達水平顯著上升，發(fā)揮抑制心肌肥大、心室重構(gòu)、心肌細胞凋亡等內(nèi)源性保護性作用[26]。GDF-15 水平與心力衰竭的嚴重程度呈正相關，聯(lián)合NT-proBNP 有利于對心力衰竭進行診斷和預后評估[27]。研究表明，心力衰竭患者GDF-15 和NT-proBNP 在心肺氣虛證、氣陰兩虛證、氣虛血瘀證、陽虛水泛證的演變中依次升高[28]，提示該指標可為心力衰竭嚴重程度判斷提供依據(jù)。

2 多組學與心力衰竭氣虛血瘀證標志物客觀化研究

組學技術在證候研究中應用廣泛，可用于區(qū)分證候、探索證候潛在標志物及中藥對證治療的療效評估[29]。但中醫(yī)證候往往存在復雜、動態(tài)多變的特點，需采用多組學聯(lián)用的方法，對生物信息學和臨床數(shù)據(jù)開展聯(lián)合及相關性分析，從而更全面、更精準地闡明證候的發(fā)生機制。

2.1 基因組學 基因組學是對生物體所有基因進行集體表征、定量研究的交叉學科[30]，包括結(jié)構(gòu)基因組學和功能基因組學。謝慧文等[31]研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者ACE 基因型及等位基因頻率在多種證型間均存在差異。駱杰偉等[32]發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（NET，SLC6A2）基因啟動子區(qū)甲基化異常升高是心力衰竭的危險因素之一，且甲基化程度越高，氣虛、血瘀程度越重。李小茜等[33]以慢性心力衰竭（CHF）氣虛血瘀證、氣陰兩虛證與健康對照組為研究對象，進行差異表達miRNAs 的初步篩選與分析，分別篩選出氣虛血瘀證、氣陰兩虛證差異表達miRNAs共18 條和102 條，可為氣虛血瘀證、氣陰兩虛證兩者辨證分型提供客觀依據(jù)。

2.2 蛋白質(zhì)組學 蛋白質(zhì)組學是基因?qū)W的動態(tài)描述，與中醫(yī)基礎理論的整體觀和系統(tǒng)性相似，因而具有高效解碼證候生物學基礎的潛力，不同證候可能是蛋白質(zhì)表達時相性和異質(zhì)性的結(jié)果[34]。見表1。

表1 心力衰竭氣虛血瘀證相關蛋白質(zhì)標志物的研究Tab.1 Study on protein markers related to qi deficiency and blood stasis syndrome in heart failure

孟永梅等[35]利用同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）技術，對健康人組和慢性心力衰竭氣虛血瘀證組血清進行差異蛋白表達分析，鑒定出16 個差異蛋白質(zhì)，包括載脂蛋白E、半乳糖凝集素-3 結(jié)合蛋白、補體9 等11 個差異蛋白表達上調(diào)，以及維生素D 結(jié)合蛋白、胰蛋白酶抑制劑等5 個差異蛋白表達下調(diào)，為心力衰竭氣虛血瘀證的客觀研究開拓新思路。

李小茜等[33]采用蛋白芯片技術對慢性心力衰竭竭（CHF）氣虛血瘀證患者和健康人的舌苔樣本進行檢測，篩選得到差異蛋白7 種，其中CXCR4 表達下調(diào)，其余骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）、CD30、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）等6 種蛋白表達上調(diào)，推測TGF-β1/BMP、CaN-NFAT3 信號通路可能與氣虛血瘀證的形成有關，為繼續(xù)探究CHF 氣虛血瘀證更具體的病理基礎提供新思路。

吳昱杰等[36]利用非靶向定量蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）技術對CHF 氣虛血瘀證大鼠進行血清蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣虛血瘀證模型組相比空白對照組檢測出差異表達蛋白144 個，且經(jīng)復方人參補氣顆粒干預后回調(diào)的蛋白有56 個，涉及通路主要與選擇性自噬、血小板活化和鈣離子激活、信號轉(zhuǎn)導等生物過程相關。后續(xù)采用靶向定量蛋白質(zhì)組學非數(shù)據(jù)依賴性采集（DIA）技術對6 個候選差異蛋白（免疫球蛋白、Tln1、Fgg、Aldoa、Fgb、coagulationfactorⅦ）進行驗證，發(fā)現(xiàn)與DDA 中變化趨勢相一致，提示以上蛋白可作為氣虛血瘀證標志物。

楊艷玲等[37]以缺血性心肌病心力衰竭氣虛血瘀證患者為研究對象，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）技術，發(fā)現(xiàn)47 個異常表達的蛋白峰，進一步分析得到熱休克蛋白60、補體C3f 和纖維蛋白原3 種特異標志物，為發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證特異的分型蛋白奠定基礎。

李琪琳等[38]建立心梗后心力衰竭氣虛血瘀證大鼠模型，利用雙向凝膠電泳（2-DE）和MALDI-TOFMS 技術篩選出大鼠心肌線粒體差異蛋白，并用曲美他嗪干預氣虛血瘀證大鼠，得出可使差異趨勢逆轉(zhuǎn)的18 個蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜分析成功鑒定出應激蛋白70（Stress-70）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶、核仁磷酸蛋白（Nucleophosmin）、α-烯醇酶、ATP 合成酶α 亞基（ATP-α）等10 個蛋白，涉及能量代謝、應激反應、氧化損傷等過程。并運用蛋白免疫印跡技術進行驗證表明Stress-70、Nucleophosmin 表達上調(diào)，ATP-α 表達下調(diào)，進一步證明以上物質(zhì)可作為心力衰竭氣虛血瘀證標志物。

2.3 代謝組學研究 代謝組學方法可探究生物體系在受到內(nèi)在和外在因素擾動或刺激后所有內(nèi)源性小分子代謝物的組成及含量變化。代謝組處于系統(tǒng)生物學的最下游，在一定程度上放大了基因組和蛋白質(zhì)組的細微功能變化，已成為中醫(yī)證候基礎研究的有效手段。見表2。

尹春園[39]建立氣虛血瘀證缺血性心力衰竭大鼠模型，應用高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法（HPLC-QTOF-MS） 技術對大鼠心肌組織中的成分進行代謝組學方法檢測，鑒別出氣虛血瘀證心力衰竭模型組大鼠區(qū)別于正常對照組的25 個生物標志物，其中谷胱甘肽、焦谷氨酸、丙酮酸等含量顯著降低，脯氨酸、丙氨酸、精氨酸等含量顯著升高。并用益氣活血顆粒干預氣虛血瘀型大鼠，發(fā)現(xiàn)其中的21 種生物標志物發(fā)生顯著回調(diào)，提示益氣活血顆?？赏ㄟ^多種代謝途徑調(diào)節(jié)心肌能量代謝，減輕氧化應激損傷，發(fā)揮對心力衰竭氣虛血瘀證的治療作用。

呂李飛等[40]運用LC-MS 技術檢測慢性心力衰竭氣虛血瘀證模型大鼠糞便代謝物，鑒定出19 個潛在的差異代謝物，包括氨基酸、嘌呤類、糖脂類及黃酮類等成分，涉及糖脂代謝、能量代謝、苯丙氨酸代謝及膽汁酸代謝等途徑。有望從以上通路深入探討，闡明CHF 氣虛血瘀證的生物學機制。

王娟等[41]利用磁共振波譜方法比較慢性心力衰竭血瘀證與非血瘀證患者血漿代謝產(chǎn)物，結(jié)果顯示氨基酸、能量代謝及脂類等11 種差異代謝物表達水平紊亂，其中組氨酸、纈氨酸、葡萄糖等物質(zhì)下降，乳酸、丙酮酸、糖蛋白等代謝物升高，為疾病診斷和中醫(yī)證候研究提供了新思路。

劉陽等[42]選用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Q-ExactiveMS/MS）分析比較心力衰竭氣虛血瘀證患者和健康人的血清內(nèi)源性差異代謝物，共鑒定出如花生四烯酸、L-丙氨酸、甘氨酰-L-亮氨酸等潛在的差異代謝物39 個，參與組織的能量代謝，當患者心肌能量代謝出現(xiàn)障礙時可導致氣血運行不暢，該結(jié)果與氣虛血瘀證病機一致。

王鵬軍等[43]以缺血性心力衰竭氣虛血瘀證患者為研究對象，利用高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜技術（HPLC-TOF-MS）對患者血清樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)精氨酸、磷脂酰乙醇胺、N-（2-羥乙基）十七烷基酰胺等4 種代謝物含量相比健康人變化顯著，表明磷脂代謝、氨基酸代謝紊亂與心力衰竭氣虛血瘀證的發(fā)病密切相關。

劉玲玲[44]以慢性心力衰竭氣虛血瘀證、陽虛水停證患者為研究對象，應用LC-MS 技術檢測患者的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)精氨酸、泛酸、2-氨基己二酸等6 種差異性最大，涉及精氨酸代謝、能量代謝等途徑，可作為將區(qū)分兩種證型的差異代謝物，為中醫(yī)證候的診斷提供依據(jù)。

3 討論

人體是精密復雜的系統(tǒng)，中醫(yī)證型涉及的生物學標志物也往往是多層面和多維度的群集，單一指標并不能完全闡明中醫(yī)證候的本質(zhì)，且某些指標（如生化指標）與證型相關性的結(jié)果可能并不一致。技術分析手段是證候生物學本質(zhì)研究的重要突破口。綜合現(xiàn)有的研究表明，心力衰竭氣虛血瘀證的潛在標志物是一個包含理化指標、基因、蛋白質(zhì)、代謝組學的多系統(tǒng)、多維度復雜網(wǎng)絡。需要采用整體與動態(tài)變化的視角，將各維度標志物與心力衰竭氣虛血瘀證相互關聯(lián)，將表征心力衰竭氣虛血瘀證的宏觀、微觀多維度標志物進行整合，并進行大量反復的臨床或?qū)嶒烌炞C，才有利于更好地解釋氣虛血瘀證的科學內(nèi)涵，輔助疾病的診斷。

雖然目前對心力衰竭氣虛血瘀證的相關生物學指標研究取得了一定進展，但在研究方法或采用的技術手段上仍存在一定的不足，需要合理設計和優(yōu)化研究方法：1）不同研究采用的氣虛血瘀證診斷標準存在差異而導致研究結(jié)果不同，缺乏可比性，需要規(guī)范心力衰竭氣虛血瘀證診斷標準，更好地實現(xiàn)“病證結(jié)合”。2）研究者對中醫(yī)辨證的準確度參差不一，可能導致納入受試者的過程存在差異，需要系統(tǒng)培訓研究人員，并進行監(jiān)督管理。3）分組不合理可能導致研究結(jié)果不準確。以心力衰竭氣虛血瘀證的相關代謝組學研究為例，其設計多以健康受試者和心力衰竭氣虛血瘀證患者為對照，以說明心力衰竭氣虛血瘀證和健康人的血漿差異代謝物，然而此差異代謝物很可能并不是氣虛血瘀證與非氣虛血瘀證間的差異代謝物，而是心力衰竭患者和健康人的差異代謝物。因此需要采取更合理的頂層設計，研究分組需要更全面，將表征心力衰竭的分子標志物與氣虛血瘀證的分子標志物更好地進行統(tǒng)一。4）組學生物標志物研究設計缺少實驗驗證或擴大樣本量的驗證。絕大多數(shù)研究僅僅停留于發(fā)現(xiàn)證候的差異生物標志物，未進一步進行大樣本隊列驗證，未進行動物及細胞實驗驗證或?qū)ι舷掠瓮愤M行關聯(lián)分析，導致結(jié)論可信度降低，無法有效應用于臨床。迫切需要優(yōu)化和改進以上存在的問題和不足，為更好地探究證候生物學物質(zhì)基礎做鋪墊。