屈凡凡，沈愛花，張聲生，李吉磊

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC） 是以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)的慢性非特異性炎癥性疾病[1]。UC 屬中醫(yī)“久痢”的范疇，張聲生教授臨床多用清化祛瘀健脾方治療脾虛濕熱夾瘀型UC，具有良好臨床療效，且本課題組前期針對清化祛瘀健脾方開展了大量的臨床與基礎(chǔ)研究，證實了清化祛瘀健脾方具有抑制氧化應(yīng)激、減輕腸道炎癥反應(yīng)的作用[2-4]，但其發(fā)揮藥理作用的深層分子機(jī)制尚不十分明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-藥物” 網(wǎng)絡(luò)從整體角度分析藥物與機(jī)體的作用機(jī)制，被認(rèn)為是探索中藥復(fù)方機(jī)制的新視角[5]。文章以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，對清化祛瘀健脾方治療UC的主要靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測分析，并采用分子對接法模擬藥物關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)結(jié)合，評估藥物與相關(guān)基因的作用關(guān)系，最后通過動物實驗對重要靶點(diǎn)進(jìn)行驗證，以此探討清化祛瘀健脾方治療UC 的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 篩選清化祛瘀健脾方的活性成分及靶點(diǎn) 從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）獲取清化祛瘀健脾方中所用中藥的化學(xué)成分，參考文獻(xiàn)設(shè)置化合物的類藥性（DL）和口服利用度（OB）作為篩選參數(shù)，選取OB≥30%，DL≥0.18 的藥效成分庫[6]，整理活性成分所涉及的靶點(diǎn)，再通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)基因注釋和基因名校正。

1.2 篩選UC 相關(guān)基因 通過人類基因組注釋數(shù)據(jù) 庫 Genecards、OMIM、PharmGKB、DrugBank 和TDD 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選UC 相關(guān)基因，將獲取的UC 基因與清化祛瘀健脾方的靶點(diǎn)基因取交集，遴選出共享基因，利用R 軟件制作韋恩圖。

1.3 構(gòu)建有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將清化祛瘀健脾方藥物活性成分、藥物疾病共同基因的對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.9.1，繪制“清化祛瘀健脾方藥物活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建蛋白與蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)與分析核心靶點(diǎn) 將共同基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“homo sapiens”，繪制清化祛瘀健脾方治療UC 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖，設(shè)置high confidence=0.9 作為最低互作分?jǐn)?shù)。使用R 軟件計算各主要蛋白間的互作次數(shù)，并據(jù)此找到核心靶點(diǎn)，生成Barplot 核心靶點(diǎn)圖。

1.5 GO 功能與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 使用R 軟件對清化祛瘀健脾方與UC 的共同靶基因進(jìn)行GO 功能與KEGG 通路富集分析，結(jié)合文獻(xiàn)篩選出清化祛瘀健脾方治療UC 的主要分子功能和信號通路。

1.6 分子對接 對上述清化祛瘀健脾方中的活性成分和核心靶基因進(jìn)行分子對接，從RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫獲取受體蛋白的晶體復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)文件，然后使用AutoTools 移除受體蛋白的原配體，并進(jìn)行加氫去水分子處理。從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取主要活性成分的2D 化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用Chem3D 軟件將其轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)。結(jié)合文獻(xiàn)檢索到受體蛋白活性位點(diǎn)的結(jié)果，使用AutoDock 軟件進(jìn)行活性位點(diǎn)的搜索定位。先圍繞受體可能的活性位點(diǎn)形成一個范圍較大的活性口袋，然后用不同類型的原子作為探針進(jìn)行掃描，計算格點(diǎn)能量，然后AutoDucks 程序?qū)ε潴w在活性口袋內(nèi)進(jìn)行構(gòu)象搜索，最后使用Vina 軟件將主要活性成分與相對應(yīng)的核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，對每個對接位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合自由能（affinity）評分，自由能絕對值越大，分子結(jié)合越穩(wěn)定。選擇結(jié)合自由能評分最低的對接方式，最后使用Pymol 軟件繪制分子對接圖。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 造模、分組與給藥 雄性SPF 級C57BL/6 小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自北京斯貝福實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所屏障級實驗動物室。采用公認(rèn)的葡聚糖硫酸鈉（DSS，相對分子質(zhì)量為36 000～50 000，MP 公司，批號S4140）制備UC 小鼠模型。清化祛瘀健脾方由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院草藥房提供。24 只小鼠均自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥組（清化祛瘀健脾方）各8 只。除正常組外，模型組和中藥組予3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）自由飲用6 d 造模，6 d 后換成正常飲用水。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果采取臨床等劑量為最優(yōu)劑量[2-3]，中藥組予每日14.17 g/kg 清化祛瘀健脾方灌胃，灌胃容積0.02 mL/g，正常組與模型組每日予等量蒸餾水灌胃。12 d 后處死小鼠，取結(jié)腸組織進(jìn)行后續(xù)實驗檢測。

1.7.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化 將結(jié)腸組織固定保存在4%多聚甲醛溶液中24 h 后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE 染色，觀察病理改變，根據(jù)Neurath 提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理評分[7]，積分越高表明黏膜炎癥越嚴(yán)重。

1.7.3 免疫組織化學(xué)染色 采用二步免疫組化法檢測絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3 蛋白表達(dá)水平。評分標(biāo)準(zhǔn)如下，根據(jù)染色程度評分（0～3 分別為無著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）；根據(jù)陽性范圍進(jìn)行評分（1～4 分別為0%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%）。最終評分結(jié)果= 平均陽性強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×平均陽性范圍分?jǐn)?shù)。

1.7.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測 取結(jié)腸組織，采用RIPA 裂解液提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。電泳、濕法轉(zhuǎn)至PVDF 膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）抗體，4 ℃孵育過夜。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）抗體，孵育后加入ECL 發(fā)光液顯影，采用Image J 軟件分析條帶。以Tubulin 抗體為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 清化祛瘀健脾方活性成分和潛在靶點(diǎn) 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫和TCMID 數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，獲取藥物的有效成分，去除重復(fù)的活性成分如berberine（小檗堿），quercetin（槲皮素），for-mononetin（芒柄花黃素）等共獲得86 個活性成分。匯集每個活性成分所涉及的潛在靶點(diǎn)后，再經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫校正去重，共獲得224 個潛在靶點(diǎn)。

2.2 UC 相關(guān)基因 以“ulcerative colitis”為檢索詞，在Genecards 數(shù)據(jù)庫里以“Relevance score≥1”為篩選條件，共找到2 499 個疾病相關(guān)基因，在OMIM、PharmGKB、TDD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫里分別獲得1、15、38、59 個疾病相關(guān)基因，將5 個數(shù)據(jù)庫的查詢結(jié)果合并去重，共得出2 548 個UC 的靶點(diǎn)基因，韋恩圖見圖1。與清化祛瘀健脾方活性成分潛在靶點(diǎn)對比，共有154 個共同基因，韋恩圖見圖2。

圖1 疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of disease targets

圖2 藥物與疾病的共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the common targets of drugs and diseases

2.3 清化祛瘀健脾方有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將生成的成分-靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 軟件，繪制清化祛瘀健脾方有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，圖中外圈綠色菱形為上述154 個共同基因，內(nèi)部圓形表示清化祛瘀健脾方中能與這些基因反應(yīng)的有效成分，共244 個有效成分。其中治療靶點(diǎn)最多的有效成分是槲皮素（quercetin），作用靶點(diǎn)為1 232 個；其次為山柰酚（kaempferol），作用靶點(diǎn)252 個；再次為β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用靶點(diǎn)228 個，具體見圖3。

圖3 清化祛瘀健脾方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Qinghua Quyu Jianpi Decoction component-target network diagram

2.4 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖 將上述154 個共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，選取最低所需的交互分?jǐn)?shù)為0.9 的高置信度PPI 關(guān)系數(shù)據(jù)，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，隱藏17 個孤立節(jié)點(diǎn)，見圖4。圖中共有154 個節(jié)點(diǎn)和659 條邊，節(jié)點(diǎn)的平均Degree 為8.56。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示每個基因蛋白，節(jié)點(diǎn)之間的直線代表該直線連接的2 個蛋白有相互作用關(guān)系（如共表達(dá)、蛋白質(zhì)同源性、基因鄰接、基因融合等），線越粗代表作用關(guān)系越強(qiáng)。應(yīng)用R 軟件得到互作關(guān)系排名前40 的靶點(diǎn)，并繪制Barplot 圖。見圖5。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 PPI network diagram

圖5 Barplot 圖Fig.5 Barplot plot

2.5 GO 及KEGG 富集分析結(jié)果 使用R 軟件對清化祛瘀健脾方與UC 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，篩選出前20 個基因的分子功能見圖6，主要為影響DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子的活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、信號受體激活劑的活性等。使用R 軟件進(jìn)行KEGG 通路分析，篩選出富集基因數(shù)較多的前20 條通路，見圖7。如AGE-RAGE 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK信號通路。

圖6 作用靶點(diǎn)的GO 功能富集分析Fig.6 GO functional enrichment analysis of the targets of action

圖7 KEGG 通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接結(jié)果 在PPI 網(wǎng)絡(luò)中以Degree 排序篩選前6 位的核心基因，見圖8。結(jié)合文獻(xiàn)從核心基因中篩選出與UC 密切相關(guān)的4 個關(guān)鍵基因中文名低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1A）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、MYC 和MAPK3，與其相互作用的活性成分槲皮素、甘草查爾酮A、苦參堿、柚皮素進(jìn)行分子對接，具體對接情況見表1。槲皮素（quercetin）通過氨基酸殘基GLU -122、LYS -106、ASP -104、TYR-103 和HIF1A 靶點(diǎn)蛋白形成4 個氫鍵相互作用，柚皮素（naringenin）通過氨基酸殘基ALA-188、ARG-87、ARG-84、GLN-83 和MAPK3 形成4 個氫鍵相互作用，苦參堿（matrine）通過氨基酸殘基PRO-44、LYS-45、ILE-48、PHE-27、PHE-28 和MYC 靶點(diǎn)蛋白形成5 個氫鍵相互作用，甘草查爾酮A（licochalcone a） 通過氨基酸殘基GLN-361、GKU-444 和STAT3 形成2 個氫鍵相互作用，具體對接見圖9。

表1 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對接Tab.1 Molecular docking of active ingredients to core targets

圖8 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心基因篩選Fig.8 Screening of core genes in the PPI network

圖9 分子對接細(xì)節(jié)圖Fig.9 Diagram of molecular docking details

2.7 動物實驗靶點(diǎn)驗證

2.7.1 清化祛瘀健脾方對結(jié)腸病理損傷的影響 3 組小鼠的結(jié)腸組織HE 染色見圖10A，模型組有大量杯狀細(xì)胞破壞，局部炎性細(xì)胞浸潤明顯；清化祛瘀健脾方組炎癥較模型組緩解，炎性細(xì)胞減少，隱窩結(jié)構(gòu)恢復(fù)，病理評分較模型組明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)腸病理與MAPK3 免疫組化評分（±s）Tab.2 Colonic pathological score and immunohistochemical score for MAPK3（±s） 分

表2 結(jié)腸病理與MAPK3 免疫組化評分（±s）Tab.2 Colonic pathological score and immunohistochemical score for MAPK3（±s） 分

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 例數(shù) 病理評分 MAPK3 免疫組化評分正常組 8 0.13±0.35 10.00±2.33模型組 8 3.75±0.46* 4.13±2.42*中藥組 8 1.88±0.35# 7.25±1.75#

圖10 結(jié)腸組織HE 染色（A，×200）和MAPK3 免疫組化（B，×400）Fig.10 HE staining(A，× 200) and MAPK3 immunohistochemical staining(B，× 400) of colon tissue

2.7.2 免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行靶點(diǎn)驗證 MAPK3免疫組化情況見圖10B，棕色染色程度為MAPK3的表達(dá)水平，模型組MAPK3 表達(dá)水平較正常對照組低（P＜0.01），大多為弱陽性。清化祛瘀健脾方組MAPK3 表達(dá)水平雖較模型組明顯升高（P＜0.05），大多為強(qiáng)陽性。見表2。

2.7.3 Western blot 檢測 根據(jù)核心基因和分子對接結(jié)果，選擇與UC 最可能的作用靶點(diǎn)MAPK3 進(jìn)行驗證，結(jié)果見圖11。與正常組相比，模型組中MAPK3 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，中藥組MAPK3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，中藥清化祛瘀健脾方可能通過促進(jìn)MAPK3蛋白的表達(dá)，激活MAPK 信號通路治療UC。

圖11 MAPK3 蛋白表達(dá)情況（±s）Fig.11 Expression of MAPK3 protein（±s）

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)“久痢”的范疇，為本虛標(biāo)實之證，脾虛為本，濕熱瘀毒蘊(yùn)結(jié)于腸道為標(biāo)。清化祛瘀健脾方選用黃芪等甘溫補(bǔ)氣之品以培補(bǔ)后天，黃柏等苦寒之藥清熱化濕止痢，配伍白蘞行清熱解毒，消癰散結(jié)之功。且本病下痢膿血，故用三七等化瘀止血，活血而不破血，止血而不留瘀，體現(xiàn)“行血則便膿自愈”之意。該方治療UC 的臨床療效已被廣泛認(rèn)可，但具體機(jī)制不甚明確，本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測治療UC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，然后用分子對接的方法對其有效成分和核心靶點(diǎn)結(jié)合模擬，最后對重要靶點(diǎn)進(jìn)行實驗驗證。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索，獲得清化祛瘀健脾方86 個活性成分和224 個潛在靶點(diǎn)，與疾病靶點(diǎn)取交集獲得254 個共同靶點(diǎn)，借助Cytoscape 軟件篩選出藥物-成分互作關(guān)鍵成分，如槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇等。通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選出互作關(guān)系排名前40 的靶點(diǎn)，主要包括TP53、90kDa 熱休克蛋白αA1（HSP90AA1）、STAT3、蛋白激酶Bα（AKT1）、MAPK3 等。GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)主要為影響DNA轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、信號受體激活劑的活性等。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)基因主要富集在AGE-RAGE、PI3K-Akt、MAPK 通路。為了進(jìn)一步探討藥物作用的靶點(diǎn)，研究以PPI 網(wǎng)絡(luò)分析中的Degree 值排序為基礎(chǔ)，結(jié)合文獻(xiàn)[8-11]從核心基因中篩選出與UC 密切相關(guān)的4 個關(guān)鍵基因HIF1A、STAT3、MYC 和MAPK3 進(jìn)行分子對接，探索藥物具體的結(jié)合靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)清化祛瘀健脾方中的活性成分柚皮素通過4 個氨基酸殘基與MAPK3 相互作用，且得到的結(jié)合能的絕對值最大，表明它們結(jié)合的最穩(wěn)定。后續(xù)對MAPK3 蛋白進(jìn)行動物實驗驗證，結(jié)果顯示與模型組小鼠相比，中藥組小鼠結(jié)腸組織炎癥明顯減輕，免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法均表明MAPK3 蛋白的表達(dá)明顯高于模型組。表明MAPK3 確為清化祛瘀健脾方治療UC 的靶點(diǎn)之一，這在一定程度上驗證了本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對接結(jié)果的可靠性。

MAPK 于絲/蘇氨酸蛋白激酶超家族，其可以把細(xì)胞質(zhì)的生物信號，傳遞至細(xì)胞核，進(jìn)而使細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[12]。MAPK 信號通路是細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及正常條件和病理條件下應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路。可分為4 個亞族：細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5），分別代表4 條經(jīng)典的MAPK 通路。MAPK家族中研究最為廣泛的是ERK1/ERK2 激酶（又稱：MAPK3）。該通路胞外的生長因子如激活酪氨酸激酶受體（如EGFR），提供接頭蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，招募SOS 蛋白到細(xì)胞膜上，激活胞內(nèi)的Ras/Raf 激酶?；罨腞af 激酶再進(jìn)一步與下游的MEK1/2 結(jié)合并使ERK1/2 激活。激活的ERK1/2 能夠繼續(xù)磷酸化ELK1、ETS、FOS、JUN、MYC 和SP1 等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖有關(guān)的基因表達(dá)；此外，激活的ERK1/2 也可以磷酸化多種細(xì)胞內(nèi)的激酶，對細(xì)胞的增殖和黏附產(chǎn)生作用[13]。

腸上皮細(xì)胞增殖減少和凋亡增加會破壞腸黏膜的完整性和屏障功能，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。闡明如何有效減少結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡以及如何促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖來修復(fù)黏膜組織的分子機(jī)制已成為UC 治療的重點(diǎn)[14]。研究結(jié)果表明，清化祛瘀健脾方通過上調(diào)MAPK3 蛋白的表達(dá)，激活MAPK 通路，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化、增殖，促進(jìn)UC 模型小鼠腸道干細(xì)胞的增殖、分化，并修復(fù)受損腸黏膜。另多項研究報道，MAPK3 可以調(diào)控腸黏膜上皮細(xì)胞增殖及黏膜修復(fù)[15-16]，與本研究結(jié)論一致。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，再借以分子對接技術(shù)理論模擬配體小分子與靶點(diǎn)蛋白間可能存在的結(jié)合關(guān)系，并進(jìn)行了體內(nèi)實驗驗證，詮釋了中藥清化祛瘀健脾方治療UC 的潛在機(jī)制。初步證實了清化祛瘀健脾方治療UC 是多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同參與，進(jìn)一步探索更加深入的分子機(jī)制有待后續(xù)研究驗證。