張楚欣，程宇立，胡紅林，胡瑞瑤，高琳

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.杭州樹蘭醫(yī)院中醫(yī)科，杭州 310015）

克羅米芬（Clomiphene Citrate）是改善女性排卵功能的一線藥物，常用于治療排卵功能障礙造成的女性不孕癥。其作用效果明顯，促排卵率可達70%～80%，而實際妊娠率只有30%～40%，妊娠后的流產(chǎn)率更是高達10%～25%[1]。各種人工輔助生殖技術(shù)給不孕不育人群帶來了希望，但如此低的妊娠率同時也給患者帶來焦慮與挫敗感。研究表明，克羅米芬與雌激素競爭受體位點，抑制內(nèi)源性雌激素作用，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜分泌期內(nèi)膜血管發(fā)育不良，迂曲細(xì)小，循環(huán)遲緩，造成著床窗期子宮內(nèi)膜容受性下降，最終導(dǎo)致臨床妊娠率的降低[2-3]。

當(dāng)歸散出自《金匱要略》，由當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、黃芩5 味藥物組成，是經(jīng)典的清熱安胎方劑。其中白術(shù)、黃芩清熱健脾、止血安胎，使內(nèi)膜血不妄行；當(dāng)歸、川芎、白芍養(yǎng)血活血，使胞宮得養(yǎng)。從藥物功效而言，本方可從養(yǎng)血活血與清熱止血的角度拆分為川芎-當(dāng)歸-白芍（簡稱：芎歸芍）和黃芩-白術(shù)（簡稱：黃芩白術(shù)）兩組藥物?，F(xiàn)代研究表明[4-7]，當(dāng)歸、川芎、白芍具有很好的激素樣作用，并可促進血管的新生發(fā)育，增強血液循環(huán)。而白術(shù)、黃芩這一清熱止血藥對以及當(dāng)歸散全方對子宮內(nèi)膜血管生成的影響尚不明晰。故為探究當(dāng)歸散安胎助孕功效的機制，明確方中藥物配伍作用的差異與關(guān)聯(lián)，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗，對當(dāng)歸散及其拆方干預(yù)克羅米芬所造成的子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良的有效成分、活性靶點、潛在機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 有效成分收集與作用靶點篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php）[8]檢索當(dāng)歸散（當(dāng)歸、白芍、川芎、白術(shù)、黃芩）有效活性成分，以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[9]，并補充文獻報道中常見成分[10-14]。使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）對其化合物名稱和分子結(jié)構(gòu)進行核對，再利用Swiss Target Predicition 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[15]對其活性成分進行靶點預(yù)測，以Probability≥0.1 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。將靶點導(dǎo)入UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）[16]進行基因名標(biāo)準(zhǔn)化，去重，獲得最終靶點。

1.1.2 疾病靶點篩選 以 “recurrent spontaneous abortion”“implantation dysfunction”“angiogenesis”為檢索詞，利用人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCard）數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org）、人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）檢索疾病靶點，以Relevance score≥5 作為GeneCard 數(shù)據(jù)庫靶點篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html） 對上述3 個關(guān)鍵詞檢索得到的靶點取交集，得到疾病靶點，再與當(dāng)歸散及其拆方活性成分相應(yīng)靶點取交集，分別獲得當(dāng)歸散及其拆方治療子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良的作用靶點。

1.1.3 核心蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選得到的作用靶點以gene symbol 形式上傳到String 數(shù)據(jù)庫11.5（https：//cn.string-db.org/），限定研究物種為“Homo sapiens”，進行核心PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，并運用R 軟件繪制排名前10 的核心靶點Degree 值條形圖。

1.1.4 “中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，運用Network Analyzer 功能進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.1.5 基因本體論（GO）功能、京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 使用R 4.2.2 軟件，借助R 包“clusterProfiler”“pathview”[17-18]等，設(shè)定P＜0.05，進行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物 60 只SPF 級9 周齡健康性成熟雌性未孕SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格許可證號為SCXK（京）2021-0006。所有動物提前1 周購入，每籠5 只，光照節(jié)律12 h 光∶12 h 暗（6：00-18：00），相對濕度50%±5%，溫度20～25℃，普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。研究方案獲北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：BUCM-1-2022121001-0009）。

1.2.2 試劑與藥物 當(dāng)歸散：當(dāng)歸30 g，黃芩10 g，白術(shù)30 g，川芎30 g，芍藥30 g（北京同仁堂藥業(yè)有限公司供應(yīng)，經(jīng)鑒定均符合2020 年版《中國藥典》相關(guān)規(guī)定），購于北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部；枸櫞酸克羅米芬法地蘭片（塞浦路斯高特制藥有限公司，批號：F0203，《進口藥品注冊證》 證號：H20091079HK-24713）；阿司匹林腸溶片（Bayer HealthCare Manufacturing S.r.l 公司，批號：BJ11641，《進口藥品注冊證》證號：H20090978）；10%福爾馬林溶液（益利化工有限公司，020126）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末（索萊寶生物科技有限公司，P1010-2）；兔抗酪氨酸激酶2（Tie2）抗體（Santa Cruz 公司，sc-9026）；抗血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）抗體[VG-1]、抗血管內(nèi)皮生長因子受體1（FLT1） 抗體[Y103]、抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（KDR）抗體、抗血管生成素1（Ang1）抗體、抗血管生成素2（Ang2）抗體（Abcam 公司，貨號分別為ab1316、ab32152、ab39256、ab133425、ab153934）；羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP）二抗、羊抗小鼠IgG-HRP 二抗、兔抗羊IgG-HRP 二抗（Abcam 公司，貨號分別為ab97051、ab6789、ab6741）。

1.2.3 儀器 PL6001-S 型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；LEICA RM2245 切片機（萊卡上海分公司）；LEICA EG1150C 包埋機（萊卡上海分公司）；LEICAASP300S 蠟塊脫水機（萊卡上海分公司）；OLYMPUS-IX71 顯微鏡（奧林巴斯公司）。

1.2.4 供試液制備 當(dāng)歸散、芎歸芍、黃芩白術(shù)供試液制備：分別按2∶2∶2∶2∶1 比例稱取打碎后的當(dāng)歸、川芎、白芍、黃芩、白術(shù)粗粉；按2∶2∶2 比例稱取當(dāng)歸、川芎、白芍粗粉；按2∶1 比例稱取黃芩、白術(shù)粗粉。分別混合，用10 倍藥材劑量的冷水浸泡約20 min，加熱，微微沸騰30 min，過濾藥渣，藥渣加8 倍量水煮沸20 min，過濾；合并兩次煎煮后的藥汁，室溫調(diào)濃度分別為0.039、0.013、0.026 g/mL。阿司匹林溶液、克羅米芬溶液制備：分別將阿司匹林片、克羅米芬片放入研磨皿粉碎，將粉末定量轉(zhuǎn)移至含有蒸餾水的燒杯，以蒸餾水清洗研磨皿和攪拌棒3 次，并合并入燒杯中，振蕩器加速溶解混勻，室溫調(diào)濃度分別為0.65、0.975 mg/mL。

1.2.5 動物分組、造模及給藥 60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、阿司匹林組、當(dāng)歸散組、芎歸芍組和黃芩白術(shù)組，每組10 只。依據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》[19]中人與大鼠體表系數(shù)法換算法折算各用藥組給藥劑量，克羅米芬、阿司匹林臨床劑量分別依50、75 mg/60 kg 計算，則大鼠用藥劑量分別為5.21、7.812 5 mg/kg；當(dāng)歸散、黃芩白術(shù)、芎歸芍的臨床劑量依3、1、2 g/60 kg 計，則大鼠用藥劑量分別為0.312 5、0.104、0.208 g/kg。動情期后第1 天起，模型組及各給藥組每日上午給予克羅米芬溶液灌胃，連續(xù)5 d，制造穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜發(fā)育不良模型；各給藥組于每日下午給予相應(yīng)藥液治療，持續(xù)8 d（即動情期后第1 天至造模結(jié)束后第3 天）；正常組大鼠灌胃等劑量去離子水。

為確定大鼠動情周期和排卵日，連續(xù)7 d，于每日上午7～9 時，棉簽蘸取少許生理鹽水獲取陰道分泌物做涂片，涂片干燥后用瑞-吉氏復(fù)合染液，鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量及特點。大鼠的動情周期分為排卵前期、排卵期、排卵后期、排卵間期，據(jù)《動物實驗方法學(xué)》[20]，排卵前期：有核上皮細(xì)胞占多數(shù)，偶有角化細(xì)胞和白細(xì)胞；排卵期：角化上皮細(xì)胞堆聚，極少數(shù)白細(xì)胞和上皮細(xì)胞；排卵后期：角化上皮細(xì)胞、白細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞堆集，比例無明顯差異；排卵間期：白細(xì)胞占多數(shù)，角化細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞基本消失。

1.2.6 標(biāo)本采集 造模結(jié)束后第4 日早晨8 時左右（著床窗期），水合氯醛麻醉大鼠后，于腹主動脈取血。室溫靜置2 h，1 000×g 離心15 min，分離血清，備用。取各組大鼠一側(cè)子宮，磷酸鹽緩沖液沖洗后，放入10%緩沖中性福爾馬林溶液，固定48 h 后，常規(guī)方法石蠟包埋、切片（厚度4 μm）。

1.2.7 指標(biāo)檢測 免疫組化（SP 法） 測定VEGFA及其受體FLT1、KDR，Ang1、Ang2 及其受體Tie2 的表達，并計算子宮內(nèi)膜微血管密度。

石蠟切片60 ℃烤片60 min，進行脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)操作，滴加正常山羊血清封閉液，室溫條件下孵育30 min；各實驗組滴加一抗（Tie2 稀釋濃度1∶50，Ang2、KDR 稀釋濃度1∶100，VEGFA、Ang1 稀釋濃度1∶200，F(xiàn)LT1 稀釋濃度1∶250），4 ℃過夜，陰性對照組以磷酸鹽緩沖液代替一抗；第2 日取出室溫放置40 min，PBS 沖洗3 次，每次5 min；滴加二抗，室溫條件孵育1 h；PBS 沖洗3 次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素溶液，室溫孵育30 min；PBS 沖洗后，滴加DAB 顯色劑顯色，自來水充分洗滌后復(fù)染、脫水，中性樹脂封片。

每組選取10 張切片，每張切片隨機取3 個不同視野，在背景一致、曝光時間等一致的情況下，于400 倍顯微鏡下拍照各待測指標(biāo)切片，并用image-Pro Plus 軟件測定棕黃色陽性表達部位的平均光密度[IOD（sum）/area（sum）]；在200 倍視野下計數(shù)所有染色的微血管，取其平均值作為微血管密度。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊時選擇LSD 檢驗，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸散活性成分與靶點 截至2022 年4 月，共篩選出當(dāng)歸散相關(guān)有效成分73 個，其中當(dāng)歸7 個、白芍12 個、川芎14 個、白術(shù)8 個、黃芩32 個，去重后得到當(dāng)歸散有效成分67 個，芎歸芍有效成分30 個，黃芩白術(shù)有效成分40 個。通過SwissTargetPredicition數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測，經(jīng)校正和去重，最終共獲得當(dāng)歸散藥物作用靶點629 個，芎歸芍靶點480 個，黃芩白術(shù)靶點441 個。見表1。

2.2 疾病靶點 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫及OMIM數(shù)據(jù)庫篩選，截至2022 年4 月，得到“recurrent spontaneous abortion”“implantation dysfunction”“angiogenesis”共同疾病靶點66 個。當(dāng)歸散與疾病交集靶點24 個；芎歸芍與疾病交集靶點18 個；黃芩白術(shù)與疾病交集靶點21 個。芎歸芍與黃芩白術(shù)重合靶點15 個。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸散作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)含有24 個節(jié)點，209 條邊，平均節(jié)點Degree 值為17.4。其中，Degree 值排名前5 的靶點分別為VEGFA、表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）、KDR、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）。黃芩白術(shù)作用靶點Degree 值排名前5 的分別為：SRC、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、EGFR、KDR、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）。芎歸芍作用靶點Degree 值排名前5 的分別為：VEGFA、EGFR、FGF2、KDR、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）。見圖1、2。

圖1 當(dāng)歸散核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 PPI network diagram of core target of Danggui Powder

圖2 當(dāng)歸散及其拆方核心靶點互作Degree 值Fig.2 Degree value of core target of Danggui Powder and its disassembled prescriptions in interaction

2.4 當(dāng)歸散“中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將藥物活性成分、核心作用靶點等導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，得到“中藥-成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，共包括64 個節(jié)點（40 個中藥成分節(jié)點、24 個核心靶點節(jié)點）及209 條邊。節(jié)點Degree 越大，表明該節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越大。其中，Degree≥10 的靶點分別為環(huán)加氧酶2（PTGS2）、MMP9、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、EGFR、KDR、SRC、原癌基因酪氨酸蛋白激酶kit（KIT）、纖溶酶原（PLG）。見圖3。

圖3 當(dāng)歸散中藥-成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Drug-component-traget network of Danggui Powder

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析結(jié)果 GO 功能富集結(jié)果顯示，當(dāng)歸散、芎歸芍、黃芩白術(shù)作用靶點分別富集于1 524、1 309、1 380 個生物學(xué)過程（BP），當(dāng)歸散主要富集于創(chuàng)傷愈合（wound healing）、磷脂酰肌醇3-激酶信號（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號途徑（phosphatidylinositol-mediated signaling）、肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號途徑（inositol lipid-mediated signaling）、蛋白質(zhì)自磷酸化（protein autophosphorylation）；排名前5的BP 中，除共同富集于phosphatidylinositol 3-kinase signaling、phosphatidylinositol -mediated signaling、inositol lipid-mediated signaling，芎歸芍富集于上皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控（positive regulation of epithelial cell migration）、對紫外線A 的響應(yīng)（response to UV-A），黃芩白術(shù)富集于protein autophosphorylation、肌細(xì)胞增殖（muscle cell proliferation）。三者分別富集于36、27、33 個細(xì)胞組分（CC），當(dāng)歸散富集結(jié)果主要包括膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、囊泡腔（vesicle lumen）、膜小凹（caveola）、質(zhì)膜筏（plasma membrane raft）；排名前5 的CC中，除共同富集于membrane raft、membrane microdomain、caveola、plasma membrane raft，芎歸芍富集于vesicle lumen，黃芩白術(shù)富集于黏著斑（focal adhesion）。三者分別富集于94、79、86 個分子生物學(xué)功能（MF），排名前5 的MF 均為蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、跨膜受體蛋白激酶活性（transmembrane receptor protein kinase activity）、生長因子結(jié)合（growth factor binding）、血紅素結(jié)合（heme binding）。軟件篩選出排名前5 的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子生物學(xué)功能并繪制氣泡圖，泡泡節(jié)點越大則富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，當(dāng)歸散、芎歸芍、黃芩白術(shù)作用靶點分別富集于118、101、121 條通路，當(dāng)歸散主要富集于癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、松弛素信號通路（Relaxin signaling pathway）；排名前10 的通路中，除共同富集于Proteoglycans in cancer、Relaxin signaling pathway、Rap1 signaling pathway、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、低氧誘導(dǎo)因子1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、流體剪切力與動脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis），芎歸芍富集于卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、化學(xué)致癌-受體激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation），黃芩白術(shù)富集于PI3K-Akt signaling pathway、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、內(nèi)分泌耐藥（Endocrine resistance）。軟件篩選出排名前20 的通路并繪制氣泡圖，泡泡節(jié)點越大則富集基因數(shù)量越多，顏色越紅則富集越顯著。見圖4、5。

圖4 GO 功能富集分析圖Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析圖Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 各組大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度 與正常組相比，模型組大鼠的子宮內(nèi)膜微血管密度顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度提高（P＜0.05 或P＜0.01）。除黃芩白術(shù)組，其他給藥組宮內(nèi)膜微血管密度均恢復(fù)正常水平（P＞0.05）。見表2、圖6。

圖6 大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度染色（IHC，×200）Fig.6 Endometrial microvascular density staining of rats(IHC，×200)

表2 大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度（±s）Tab.2 Endometrial microvessel density of rats（±s）

表2 大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度（±s）Tab.2 Endometrial microvessel density of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 微血管密度（個/mm2）正常組 10 38.83± 7.36模型組 10 25.00± 6.43**阿司匹林組 10 41.90±11.51##當(dāng)歸散組 10 39.90±14.65##芎歸芍組 10 42.33±14.56##黃芩白術(shù)組 10 31.11±11.34*#

2.7 各組大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA、FLT1、KDR 表達水平 VEGFA 在大鼠子宮內(nèi)膜的腔上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達，以血管內(nèi)皮細(xì)胞、腔上皮、腺上皮細(xì)胞中表達明顯。FLT1 主要表達于大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞，在子宮內(nèi)膜腔上皮表達強烈。KDR在大鼠子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞、腔上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均有表達，其中在腔上皮細(xì)胞的表達最為顯著。見圖7、8、9。

圖7 大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.7 Immunohistochemical staining of VEGFA in endometrium of rats(IHC，×400)

圖8 大鼠子宮內(nèi)膜FLT1 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.8 Immunohistochemical staining of FLT1 in endometrium of rats(IHC，×400)

圖9 大鼠子宮內(nèi)膜KDR 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.9 Immunohistochemical staining of KDR in endometrium of rats(IHC，×400)

與正常組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA、FLT1、KDR 水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各用藥組大鼠子宮內(nèi)膜FLT1、KDR 水平均升高（P＜0.05 或P＜0.01），除黃芩白術(shù)組，其余各用藥組大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA 水平均顯著升高（P＜0.01）。與阿司匹林組、黃芩白術(shù)組，當(dāng)歸散組、芎歸芍組大鼠子宮內(nèi)膜FLT1 的表達水平顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA、FLT1、KDR 表達水平（±s）Tab.3 Expression levels of VEGFA，F(xiàn)LT1 and KDR in endometrium of rats（±s）

表3 大鼠子宮內(nèi)膜VEGFA、FLT1、KDR 表達水平（±s）Tab.3 Expression levels of VEGFA，F(xiàn)LT1 and KDR in endometrium of rats（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與當(dāng)歸散組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01；與芎歸芍組比較，▲▲P＜0.01。

KDR IOD（sum）/area（sum）正常組 10 0.058±0.027 0.058±0.017 0.060±0.021模型組 10 0.002±0.004** 0.004±0.002** 0.021±0.008**阿司匹林組 10 0.042±0.015*## 0.030±0.018**## 0.058±0.033##當(dāng)歸散組 10 0.035±0.018**## 0.061±0.022##△△ 0.055±0.022##芎歸芍組 10 0.060±0.010##△△ 0.059±0.020##△△ 0.066±0.023##黃芩白術(shù)組 10 0.004±0.007**△△▽▽▲▲0.040±0.012**##▽▽▲▲0.041±0.015*#△▲▲組別 動物數(shù) VEGFA IOD（sum）/area（sum）FLT1 IOD（sum）/area（sum）

2.8 各組大鼠子宮內(nèi)膜Ang1、Ang2、Tie2 表達水平 Ang1 在大鼠子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞表達明顯，在腺體、上皮細(xì)胞表達較弱。Ang2 在大鼠子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞均有表達，其中在腺上皮細(xì)胞表達最為顯著。Tie2 在大鼠子宮內(nèi)膜的腔上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞均有表達，在腔上皮細(xì)胞表達更為顯著。見圖10、11、12。

圖10 大鼠子宮內(nèi)膜Ang1 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.10 Immunohistochemical staining of ANG1 in endometrium of rats(IHC，×400)

圖11 大鼠子宮內(nèi)膜Ang2 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.11 Immunohistochemical staining of ANG2 in endometrium of rats(IHC，×400)

圖12 大鼠子宮內(nèi)膜Tie2 免疫組化染色（IHC，×400）Fig.12 Immunohistochemical staining of Tie2 in endometrium of rats(IHC，×400)

與正常組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜Ang1、Ang2、Tie2 水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠子宮內(nèi)膜Ang1、Ang2、Tie2 的表達水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與阿司匹林組、當(dāng)歸散組、黃芩白術(shù)組相比，芎歸芍組大鼠子宮內(nèi)膜Ang1升高（P＜0.05）。阿司匹林組、芎歸芍組大鼠子宮內(nèi)膜Tie2 恢復(fù)至正常水平（P＞0.05）。見表4。

表4 大鼠子宮內(nèi)膜Ang1、Ang2、Tie2 表達水平（±s）Tab.4 Expression levels of Ang1，Ang2 and Tie2 in endometrium of rats（±s）

表4 大鼠子宮內(nèi)膜Ang1、Ang2、Tie2 表達水平（±s）Tab.4 Expression levels of Ang1，Ang2 and Tie2 in endometrium of rats（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與阿司匹林組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與當(dāng)歸散組比較，▽P＜0.05；與芎歸芍組比較，▲P＜0.05。

Tie2 IOD（sum）/area（sum）正常組 10 0.048±0.015 0.081±0.019 0.067±0.018模型組 10 0.015±0.013** 0.043±0.012** 0.029±0.009**阿司匹林組 10 0.037±0.015## 0.071±0.018**# 0.058±0.012##當(dāng)歸散組 10 0.044±0.018## 0.094±0.016##△△ 0.052±0.010**##芎歸芍組 10 0.057±0.015##△▽ 0.095±0.023##△△ 0.057±0.011##黃芩白術(shù)組 10 0.038±0.013##▲ 0.080±0.023##△△ 0.043±0.018**#△△▽▲組別 動物數(shù)Ang1 IOD（sum）/area（sum）Ang2 IOD（sum）/area（sum）

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性的良好呈現(xiàn)與多種因素有關(guān)，其中，血管生成的狀態(tài)被認(rèn)為是衡量子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)準(zhǔn)之一[21-22]。研究表明，克羅米芬在發(fā)揮促排卵作用的同時，會使子宮內(nèi)膜微血管密度、血液灌注量出現(xiàn)降低趨勢[2]，螺旋動脈血流受阻[23]，導(dǎo)致子宮動脈血流阻力指數(shù)（RI）明顯增加[24]，影響子宮內(nèi)膜容受性，最終造成著床障礙及妊娠率的降低。

故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，以“recurrent spontaneous abortion （復(fù)發(fā)性流產(chǎn)）”“implantation dysfunction （著床障礙）”“angiogenesis （血管生成）”3 個關(guān)鍵詞共同描述克羅米芬造成的子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良狀態(tài)，查找疾病靶點，并與當(dāng)歸散及其拆方有效成分作用靶點取交集，得到當(dāng)歸散及其拆方干預(yù)克羅米芬所致子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良的核心作用靶點，并進一步預(yù)測相關(guān)功能及信號通路。研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸散干預(yù)子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良可能有VEGFA、EGFR、FGF2、KDR、SRC、FLT1 等關(guān)鍵靶點的參與，涉及創(chuàng)傷愈合、PI3K 信號、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號途徑等生物學(xué)功能，膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔等細(xì)胞組分，蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等分子生物學(xué)功能，以及PI3K-AKT 信號通路、Rap1 信號通路、松弛素信號通路等信號通路。芎歸芍與黃芩白術(shù)兩部分拆方共同靶點15 個，芎歸芍特有靶點VEGFA、FGF2、凝血因子3（F3），排名前10 的通路中特有的為Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、MAPK signaling pathway、Chemical carcinogenesis - receptor activation，作用集中于調(diào)節(jié)血管生成（VEGFA、FGF2）及凝血功能（F3）[25-27]；黃芩白術(shù)特有靶點PLG、KIT、血小板衍生生長因子受體β（PDGFRB）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（NOS3）、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶（mTOR）、磷脂酰肌醇3 激酶催化亞基α（PIK3CA），排名前10 的通路中特有的為PI3K -Akt、Lipid and atherosclerosis、Endocrine resis tance，作用集中于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（PIK3CA、MTOR、KIT）[28-30]、血管生成（NOS3、PDGFRB）[31-32]及凝血功能（PLG）[33]。從上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸散全方的預(yù)測結(jié)果是兩部分拆方協(xié)同作用的綜合體現(xiàn)，兩部分拆方部分靶點重合，作用均與血管生成密切相關(guān)。而兩部分拆方相比，芎歸芍可能通過直接影響相關(guān)因子水平，對血管生成進行調(diào)節(jié)，而黃芩白術(shù)作用于多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，可能通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活程度，間接影響血管生成過程。兩部分拆方作用的差異與聯(lián)系，既與兩部分拆方中醫(yī)功效的差異相應(yīng)，也反映出同一方劑中各藥物配伍的相互協(xié)同作用。

VEGFA 是重要的血管生成因子，與受體KDR結(jié)合，能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，促進血管生成；與受體FLT1 結(jié)合，可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，提高毛細(xì)血管的通透性。在雌、孕激素等因素作用下，圍著床期子宮內(nèi)膜VEGF 及其受體FLT1、KDR 的局部高表達促進了內(nèi)膜毛細(xì)血管新生及血管網(wǎng)的建立完善，利于胚胎著床及早期絨毛血管的形成，為胚胎進一步發(fā)育提供了必要條件[34-35]。

另有研究顯示，Ang1、Ang2 及其共同的受體Tie2 是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子，是子宮內(nèi)膜血管生成的第2 套重要系統(tǒng)，在圍著床窗期與VEGF 協(xié)同調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管的生成。其中，Ang1與Tie2 結(jié)合可以促進新生血管的維持及穩(wěn)定，Ang2與Tie2 結(jié)合則會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間及內(nèi)皮細(xì)胞與支持細(xì)胞間出現(xiàn)解離，減少血管的穩(wěn)定性，但同時可使子宮內(nèi)膜血管接受足夠濃度雌激素、VEGF 等分子提供的出芽信號，從而促進血管重構(gòu)及新生[36-37]。Ang1 和Ang2 于胚胎著床窗口期呈現(xiàn)高表達，參與著床期絨毛生成及胎母毛細(xì)血管網(wǎng)建立，促進胚胎植入以及毛細(xì)血管的新生、成熟和穩(wěn)定[38]。

本研究通過對當(dāng)歸散及其拆方的成分靶點分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸散及拆方中所含成分均能直接或間接影響VEGF 及其受體FLT1、KDR，但并未顯示出與Ang1、Ang2 及其受體間可能的相互作用。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身是建立在現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的分析手段，極大依賴于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，這也使其所能提供的信息具有一定的局限性、滯后性。故本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)合已有實驗研究及相關(guān)文獻報道，除選定以VEGFA 及其受體FLT1、KDR此類公認(rèn)作用靶點外，另對血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子Ang1、Ang2 及其受體Tie2 進行了研究，并以微血管密度作為效應(yīng)指標(biāo)進行考察，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與動物實驗相結(jié)合的方法，探究當(dāng)歸散對子宮內(nèi)膜血管發(fā)育的影響。此外，為考察兩組功效不同的拆方對子宮內(nèi)膜血管發(fā)育的影響水平是否存在差異，拆方同樣被納入動物實驗進行探究。

對克羅米芬的研究也發(fā)現(xiàn)，克羅米芬通過競爭性抑制內(nèi)源性雌激素的負(fù)反饋作用，使垂體促卵泡刺激素和促黃體生成素分泌增多，從而發(fā)揮其促排卵功能。而雌激素可誘導(dǎo)VEGF 產(chǎn)生、抑制Ang1 合成，增加胚胎干細(xì)胞（ESC）的Ang2/Ang1 比例[35，39]；且VEGF 及雌激素等可促進Ang2 的表達[40-41]。在本實驗結(jié)果顯示，動情期后連續(xù)5 d 給予大鼠5.2 mg/kg克羅米芬灌胃量，明顯導(dǎo)致大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度，VEGFA 及其受體FLT1、KDR，Ang1、Ang2 及其受體Tie2 表達水平下降。從雌激素、VEGFA 和Ang2之間的關(guān)系推測，克羅米芬可能正是通過降低雌激素的表達，間接抑制了VEGF 及Ang2 的表達。而模型組大鼠子宮內(nèi)膜Ang1 表達水平的下降則提示，克羅米芬在影響子宮內(nèi)膜血管新生的同時，可能對血管的穩(wěn)定性也產(chǎn)生干擾，這與前文所述雌激素與Ang1 的調(diào)節(jié)關(guān)系不相符，說明克羅米芬可能同時通過其他途徑對Ang1 的表達造成影響，具體機制有待研究。

實驗結(jié)果顯示，當(dāng)歸散及其拆方都能在一定程度上緩解克羅米芬對子宮內(nèi)膜血管生長的損害，上調(diào)子宮內(nèi)膜血管生成的相關(guān)因子VEGFA、Ang1、Ang2 及其受體的表達，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體的預(yù)測結(jié)果相符。其中，芎-歸-芍對大鼠子宮內(nèi)膜血管生成的促進作用優(yōu)于當(dāng)歸散，而黃芩-白術(shù)的作用又明顯低于當(dāng)歸散。究其原因，當(dāng)歸、川芎、白芍是婦科常用的活血養(yǎng)血安胎藥，既有很好的雌激素樣作用，又能改善血液循環(huán)、促進血管發(fā)育[4-7]；黃芩、白術(shù)為安胎圣藥，以止血作用為主[42-43]，故對血管生成的促進作用略遜一籌。不過其他研究表明，黃芩能夠抗炎、抑制超促排卵后多種細(xì)胞因子的異常升高、增強淋巴細(xì)胞的增殖及吞噬細(xì)胞的功能[44-46]；白術(shù)也有抗凝血、促淋巴細(xì)胞增殖、改善免疫的功能[47-49]，這些都是黃芩白術(shù)促進子宮內(nèi)膜血管生成因子表達的可能途徑，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃芩白術(shù)可能作用于多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白，從多個途徑發(fā)揮廣泛作用的結(jié)果相一致。而當(dāng)歸散的作用介于黃芩白術(shù)和芎歸芍之間，融合了兩者的功效，既增強了黃芩白術(shù)在促進血管生成方面的作用，又抑制了芎歸芍可能引起的血管異常增生、過度增殖的作用，整體作用更為平和。這對于指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義，對于患者胎動不安的少量出血，可以增加黃芩白術(shù)的用量，達到清熱安胎的效果；而對于氣血虧虛者則可以適當(dāng)調(diào)整芎歸芍的配伍，達到養(yǎng)血活血的功效。

綜上所述，當(dāng)歸散及其拆方可以不同程度地改善克羅米芬造成的大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度下降，恢復(fù)VEGFA 及其受體FLT1、KDR，Ang1、Ang2 及其受體Tie2 表達水平，提高子宮內(nèi)膜的容受性。綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動物實驗結(jié)果，芎歸芍促進血管生成效果最突出；黃芩白術(shù)同樣對子宮內(nèi)膜血管發(fā)育有促進作用，其機制可能以間接途徑為主；當(dāng)歸散全方則綜合了兩部分拆方的協(xié)同效果，整體作用更為平和，對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。本研究僅通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及整體實驗得出的初步結(jié)論，今后將深入探究當(dāng)歸散對圍著床窗期子宮內(nèi)膜血管的確切作用機制，進一步驗證EGFR、SRC 等潛在靶點的作用，并結(jié)合PI3K-AKT 信號通路、Rap1 信號通路等可能參與其中的信號通路，進一步挖掘其方中配伍的協(xié)同作用及差異藥效機制，以為臨床應(yīng)用提供更明確的實驗依據(jù)。