劉愛茹，李華君，王立新，姬云妍，王亞男，王元松，蘇秀海，呂樹泉

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科，滄州 061000）

非酒精性脂肪肝炎（NASH）又稱代謝性脂肪性肝炎，是非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的進一步進展，以脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣化和小葉炎癥為特征[1-2]。NASH 與炎癥和纖維化有關(guān)，其終末期可能進展為肝硬化和肝細(xì)胞癌[3-6]。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)NASH 約占NAFLD 的25%[7-9]。NASH 給社會經(jīng)濟和公共衛(wèi)生帶來巨大負(fù)擔(dān)，同時也引起了人們對NASH的重視，因此開發(fā)安全有效的藥物延緩疾病進展已成為該領(lǐng)域研究的熱點之一。

雖然NASH 在其流行病學(xué)、病理生理學(xué)和確定治療靶點方面取得了穩(wěn)步進展，但在系統(tǒng)治療領(lǐng)域仍進展緩慢[10]。臨床將調(diào)整飲食、增加運動量等手段作為控制體質(zhì)量和減脂的基礎(chǔ)治療方法，但仍需配合用藥進行綜合治療。近年來中藥抗NASH 的研究[包括降血脂、抗氧化、抗炎、抗纖維化、改善胰島素抵抗（IR）等方面]越來越深入。中藥多靶點綜合性治療NASH 可能是其好于西藥的一個潛在優(yōu)點，所以研究中藥對NASH 的治療作用成為了新的研究方向[11]。

清熱祛濁膠囊（QRQZ）是河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床多用于NAFLD、NASH、肥胖、2 型糖尿病等治療，具有清熱利濕、滌痰祛瘀之功效[12]。臨床研究表明，該方對NASH 療效顯著，然而作用機制尚未明確。本研究以蛋氨酸和膽堿缺乏（MCD）誘導(dǎo)的NASH 模型小鼠為研究對象，首先評估QRQZ 的治療作用；其次研究本方對核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）通路的影響，初步揭示其機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60 只6～8 周齡健康的C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK（京）2019-0030]。明暗周期為12 h 的環(huán)境下保持（25±2）℃的恒溫，相對濕度為50%±15%，讓其自由飲水和進食，所有動物實驗已被河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑 QRQZ 購自滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（批號：220308）；多烯磷脂酰膽堿膠囊（PPC）購自賽諾菲（北京）制藥有限公司（批號：CBJD106）；MCD飼料（蔗糖45.53%，碳酸氫鈉0.75%，玉米淀粉15%，麥芽糊精5%，纖維素3%，玉米油10%，多種礦物質(zhì)S10001 3.5%，多種維生素V100011%，蛋氨酸0%，膽堿0%，丙氨酸0.35%，精氨酸1.21%，天冬酰胺0.6%，冬氨酸0.35%，胱氨酸0.35%，谷氨酸0.4%，甘氨酸2.33%，組氨酸0.45%，異亮氨酸0.82%，亮氨酸1.11%，賴氨酸1.8%，苯丙氨酸0.75%，脯氨酸0.35%，絲氨酸0.35%，蘇氨酸0.82%，色氨酸0.18%，酪氨酸0.5%，纈氨酸0.82%）購自北京斯貝福有限公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，貨號：C009-2-1），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，貨號：C010-2-1），三酰甘油（TG，貨號：A110-1-1），總膽固醇（TC，貨號：A111-1-1），超氧化物歧化酶（SOD，貨號A001-3-2），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，貨號A005-1-2），丙二醛（MDA，貨號A003-1-2）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β，貨號H002-1-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，貨號H007-1-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，貨號H052-1-2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購于藍(lán)基生物科技有限公司；NF-κB P65 抗體（貨號10745-1-AP）、核因子κB 抑制蛋白（IκB）抗體（貨號10268-1-AP）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（貨號20536-1-1AP）均購于proteintech；活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cleaved Caspase-1）抗體（貨號22915-1-AP）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白（p-IκB）抗體（貨號bs-18128-R）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）抗體（貨號bs-1185R）、NLRP3 抗體（貨號bs-10021R）購于博奧森生物有限公司；磷酸化κB P65（p-NF-κB P65）抗體（貨號#3033）購于CST 公司；mature 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（貨號ab283818）購于abcam。

2 實驗方法

2.1 高脂飲食誘導(dǎo)NASH 小鼠模型建立與分組 將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后隨機分為正常組、模型組、PPC 組、QRQZ 低劑量組、QRQZ 中劑量組、QRQZ 高劑量組，每組10 只。除正常組給予正常飲食外，其余5 組實驗組均給予MCD 飲食持續(xù)8 周。從第5 周開始，PPC 組每天灌胃給予88 mg/kg 的PPC，QRQZ低劑量組、QRQZ 中劑量組、QRQZ 高劑量組分別給予482 mg/kg、964 mg/kg、1 929 mg/kg 的QRQZ，正常組與模型組平行給予等體積的生理鹽水作為溶媒對照。清熱祛濁膠囊小鼠給藥劑量是通過小鼠與人體表面積換算為人等效劑量，清熱祛濁膠囊中劑量為人等效劑量，清熱祛濁膠囊低劑量為清熱祛濁膠囊中劑量的0.5 倍，清熱祛濁膠囊高劑量為清熱祛濁膠囊中劑量的2 倍。每7 d 稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。

2.2 生化指標(biāo)檢測 將肝臟與生理鹽水按質(zhì)量：體積=1∶9 的比例混合后，在冰水浴上超聲勻漿完全破碎，用2 500 r/min 離心10 min 后取上清即為10%肝組織勻漿，離心半徑為8.6 cm（下同），按照試劑盒步驟要求檢測TG、TC、SOD、MDA、GSH-Px 的濃度。

摘眼球取血，將收集到的血液以3 000 r/min 離心15 min，收集血清，按照試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中ALT、AST 水平。

2.3 肝組織病理學(xué)染色 QRQZ 干預(yù)4 周后，取出的新鮮小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定和-80 ℃凍存，固定不少于48 h，而后再通過梯度乙醇脫水，制備石蠟切片。對切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)改變。將速凍的新鮮肝組織制作成冰凍切片，經(jīng)油紅O 染色后光鏡下觀察肝組織內(nèi)脂肪的聚集。

2.4 ELISA 檢測 肝組織IL-1β、IL-6 以及TNF-a均使用雙抗體一步夾心法ELISA 測試。簡言之，在包被了捕獲抗體的微孔中加入待測樣本、標(biāo)準(zhǔn)品與檢測抗體，經(jīng)溫浴并徹底洗滌后，加入反應(yīng)底物顯色，經(jīng)酶標(biāo)儀測定吸光度后，利用標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得每個樣本的待測物質(zhì)濃度。

2.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測 通過qPCR，從肝臟組織中提取總RNA 后，確定NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1B 的mRNA 的肝臟表達(dá)。引物序列見表1。mRNA 的表達(dá)相對于Actb。以2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）分析相關(guān)蛋白水平 采用Western blot 法檢測肝組織中NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白信號關(guān)鍵因子IκB、P65、NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、mature IL-1β 蛋白水平。在取得的小鼠肝臟組織中加入RIPA 裂解緩沖液，進行勻漿離心，提取總蛋白，并用BCA 蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。應(yīng)用電泳對蛋白進行分離，將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h 并取出。取出后，將不同的兔抗小鼠一抗IκB（稀釋比例1∶4 000）、p-IκB（稀釋比例1∶4 000）、P65（稀釋比例1∶8 000）、p-P65（稀釋比例1∶2 000）、NLRP3（稀釋比例1∶2 000）、ASC（稀釋比例1∶2 000）、cleaved Caspase-1（稀釋比例1∶2 000）、mature IL-1β（稀釋比例1∶1 000）、β-actin（稀釋比例1∶10 000）加入其中，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗[羊抗兔免疫球蛋白（IgG）稀釋比例按1∶20 000]，在室溫下孵育2 h，TBST 洗膜后，加入ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影檢測，掃描電泳條帶圖像，以β-actin 為內(nèi)參檢測蛋白表達(dá)。應(yīng)用Image J 軟件計算平均光密度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS Statistics 19.0 軟件，對符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量及肝指數(shù) 造模給藥結(jié)束后，與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低，肝指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，PPC 組小鼠體質(zhì)量顯著回升，肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；QRQZ 低劑量組小鼠體質(zhì)量有所回升（P＜0.05）；QRQZ 中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著回升，肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；QRQZ高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著回升，肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。見圖1A～1B。

圖1 造模給藥后各組小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)變化（±s）Fig.1 Changes of body weight and liver index of mice in each group after modeling and administration（±s）

3.2 生化指標(biāo) 造模給藥后，模型組與正常組相比，肝臟TC、TG 以及血清ALT、AST 含量顯著升高（均P＜0.01）。與模型組相比，PPC 組（均P＜0.01）、QRQZ 低劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）、QRQZ 中劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）、QRQZ 高劑量組（均P＜0.01）小鼠肝臟TC、TG 水平以及血清ALT、AST 活性顯著降低。見圖2。

圖2 造模給藥后各組小鼠的生化指標(biāo)（±s）Fig.2 Biochemical indexes of mice in each group after modeling and administration（±s）

3.3 病理學(xué)染色 HE 結(jié)果顯示，正常組小鼠肝板排列整齊，結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠出現(xiàn)大量空泡樣脂肪變性，肝板排列紊亂以及大量炎細(xì)胞浸潤；給藥組小鼠肝臟脂肪滴空泡比例均顯著下降，炎癥細(xì)胞浸潤呈現(xiàn)一定的改善趨勢。見圖3A。油紅O 染色結(jié)果顯示，模型組肝臟有著極為嚴(yán)重的脂肪樣變，巨大的橘紅色脂肪滴占據(jù)了大部分的面積，核呈藍(lán)色；給藥干預(yù)后能在不同程度上緩解以上病變。見圖3B。

圖3 造模給藥后各組小鼠病理學(xué)的變化（×100）Fig.3 Pathological changes of mice in each group after modeling and administration(×100)

3.4 氧化應(yīng)激指標(biāo) 與正常組肝臟相比，模型組肝臟中的SOD 和GSH-Px 活性下降，而MDA 水平上升（P＜0.01）。與模型組肝臟相比，PPC 組（P＜0.01 或P＜0.05）、QRQZ 低劑量組（P＜0.05）、QRQZ 中劑量組（P＜0.01）、QRQZ 高劑量組（P＜0.01）肝臟中的SOD和GSH-Px 活性提升，MDA 水平降低。見圖4。

圖4 造模給藥后各組小鼠氧化應(yīng)激的影響（±s）Fig.4 Effects of oxidative stress of mice after modeling and administration（±s）

3.5 炎癥因子水平 ELISA 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，PPC 組（P＜0.01）肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均有所降低；QRQZ 低劑量組（P＜0.05）肝臟中炎癥因子IL-1β、TNF-α 有所降低，QRQZ 中劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均有所降低；QRQZ 高劑量組（P＜0.01）肝臟中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均有所降低。見圖5。

圖5 造模給藥后各組小鼠肝組織炎癥因子水平（±s）Fig.5 Levels of inflammatory factors in liver tissue of mice in each group after modeling and administration（±s）

3.6 肝組織NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)因子表達(dá) 運用Western blot 檢測了小鼠肝臟中NF-κB 信號通路關(guān)鍵因子IκB、p-IκB、P65、p-P65 蛋白水平。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝臟中p-IκB、p-P65水平顯著降低（P＜0.01），與模型組相比，PPC 組（P＜0.01）小鼠肝臟p-IκB、p-P65 水平顯著升高；QRQZ低劑量組（P＜0.01）小鼠肝臟p-IκB 水平顯著升高；QRQZ 中劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）小鼠肝臟p-IκB、p-P65 水平顯著升高；QRQZ 高劑量組（P＜0.01）小鼠肝臟p-IκB、p-P65 水平顯著升高。見圖6A、6B、6C。同時還檢測了小鼠肝臟中NLRP3 信號通路關(guān)鍵因子NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、mature-IL-1β 蛋白水平。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝臟中NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、mature-IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，PPC 組（P＜0.01）小鼠肝臟NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、mature-IL-1β 水平顯著降低；QRQZ 低劑量組（P＜0.01） 小鼠肝臟NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1 水平顯著降低、QRQZ 中劑量組小鼠（P＜0.01）小鼠肝臟NLRP3、ASC、cleaved Caspase -1、mature -IL -1β水平顯著降低；QRQZ 高劑量組（P＜0.01）小鼠肝臟NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、mature-IL-1β 水平顯著降低。見圖6D、6E、6F、6G、6H。

圖6 造模給藥后對各組小鼠肝組織NF-κB/NLRP3 通路的影響（±s）Fig.6 Effect of modeling administration on NF-κB/NLRP3 pathway in liver tissue of mice in each group（±s）

此外研究運用qPCR 檢測了NLRP3 通路的相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中肝臟炎癥因子NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 相對表達(dá)量增加（P＜0.01）。與模型組相比，PPC 組（均P＜0.01）、QRQZ 低劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）、QRQZ 中劑量組（P＜0.01 或P＜0.05）、QRQZ 高劑量組（P＜0.01）小鼠肝組織中炎癥因子NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 的mRNA 相對表達(dá)量均有所降低。見圖7。

圖7 造模給藥后各組小鼠肝組織中Nlrp3、Asc、Caspase1、IL-1β 基因相對表達(dá)量的影響（±s）Fig.7 Effect of relative expression of Nlrp3，Asc，Caspase1 and IL-1β genes in liver tissue of mice in each group after modeling and administration（±s）

4 討論

本研究通過MCD 飲食誘導(dǎo)NASH 模型，并給予QRQZ 干預(yù)。MCD 飲食通過減少小鼠對蛋氨酸和膽堿的攝入，導(dǎo)致極低密度脂蛋白合成減少，脂肪無法得到分解利用，脂肪不斷積累，最終形成NASH[13]。NASH 模型復(fù)制了在人類NASH 中觀察到的脂肪性肝炎和纖維化的組織學(xué)特征，包括脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞球囊化等[14]。結(jié)果顯示，模型組小鼠肝指數(shù)增大，血清中ALT 和AST 水平顯著升高，肝臟中TC 和TG 水平升高，HE 和油紅O 染色顯示模型小鼠肝臟有明顯的脂肪變性，伴有大量炎細(xì)胞浸潤，與NASH 的病理變化一致，提示造模成功。QRQZ顯著改善NASH 小鼠的肝功能異常，同時減少肝脂肪沉積。此外，本研究還選用臨床上常用于治療NASH的藥物PPC 作為陽性對照藥物[15]，結(jié)果顯示QRQZ與PPC 療效相近。

氧化應(yīng)激和炎癥之間相互影響，是NASH 的主要病理表現(xiàn)[16]。因此，本研究接下來探討了QRQZ 對NASH 小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平遠(yuǎn)高于正常組，而經(jīng)過QRQZ 干預(yù)后的小鼠抗氧化能力得到了提升。氧化應(yīng)激指當(dāng)機體受到外界不良因素刺激時會產(chǎn)生過多的氧自由基，它會打破機體原有的氧化和抗氧化系統(tǒng)間的平衡，進而導(dǎo)致肝組織損傷[17]。同時，氧化應(yīng)激也能通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 等多種致炎途徑誘發(fā)炎癥[18]。高水平的ROS 會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能破壞[19-20]。因此ROS 介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為NASH 發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[21]。SOD 和GSH-Px 是機體內(nèi)的抗氧化酶[22]。SOD 能清除脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的具有高度活性的超氧陰離子，減輕其毒性作用，保護肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能正常。GSH-Px 的主要作用是清除脂質(zhì)過氧化物，具有抗氧化作用[23]。MDA 作為氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物，是氧化應(yīng)激過程中脂質(zhì)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。MDA 可間接顯示肝細(xì)胞損傷程度，是一種衡量細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)[24]。此外，QRQZ可顯著降低炎癥因子水平。炎癥是一種常見于感染和組織損傷的適應(yīng)性反應(yīng)。當(dāng)炎癥誘導(dǎo)劑脂多糖存在時會促使大量的炎癥因子過度產(chǎn)生，從而加劇炎癥[25]。IL-1β、IL-6、TNF-α 均為重要的炎性反應(yīng)因子，由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，在機體炎性狀態(tài)下刺激免疫應(yīng)答，引起免疫性病理損傷[26]。以上結(jié)果提示抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)可能是QRQZ 治療NASH 的機制。

NF-κB/NLRP3 信號通路的活化是引起NASH小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要因素，因此本研究接下來研究了QRQZ 對NF-κB/NLRP3 通路的影響。NF-κB 是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。生理情況下，胞質(zhì)中的NF-κB 與IκB 相互結(jié)合并處于抑制狀態(tài)，脂質(zhì)沉積導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，可使NF-κB 的P65 亞基及IκB 發(fā)生磷酸化，之后磷酸化的NF-κB P65 與IκB 解離，進入細(xì)胞核中，促進多種炎癥信號相關(guān)基因表達(dá)。其中NLRP3炎癥小體是NF-κB 的重要下游信號，入核后的NFκB P65 可促進NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1B 基因表達(dá)。NLRP3 炎癥小體是一種含有NLR 蛋白和ASC 銜接蛋白的多蛋白胞質(zhì)復(fù)合物，也是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，它可以介導(dǎo)Caspase-1 活化形成cleaved Caspase-1，進而切割I(lǐng)L-1β 前體，形成成熟的IL-1β，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，QRQZ 干預(yù)后可顯著下調(diào)NF-κB/NLRP3 信號通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)，提示QRQZ 可以通過抑制NF-κB/NLRP3 信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)緩解NASH 小鼠肝臟脂肪變性。

綜上所述，QRQZ 對NASH 小鼠具有治療作用，其作用機制可能與抑制NF-κB/NLRP3 信號通路活化有關(guān)。然而，本研究的實驗還存在一些局限性，對QRQZ 治療NASH 的更深層次作用機制，如代謝組學(xué)、分子對接、系統(tǒng)藥理學(xué)和體外研究等，將會是本研究未來的探索方向。