趙倩，曾利敏，周麗平，齊林

（1.鄭州市第七人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450016；2.鄭州市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450016）

腦卒中又稱中風(fēng)、腦血管意外，是一種急性、突發(fā)性腦血管疾病。它是由腦血管阻塞或破裂引起的，導(dǎo)致血瘀，阻止血液進(jìn)入大腦，并引發(fā)與腦組織缺氧損傷相關(guān)的疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1]。缺血性腦卒中主要以腦缺血和神經(jīng)功能缺損為特征，占卒中總發(fā)病率的80%以上[2]。目前的臨床治療集中在靜脈溶栓和血管內(nèi)取栓的快速再灌注，盡管血管再通率不斷增加，但仍有近一半的患者在缺血后殘疾[3]。Janus 激酶2（JAK2）是蛋白酪氨酸激酶家族的成員，可通過多種細(xì)胞因子受體傳遞信號(hào)，其被激活時(shí)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3），進(jìn)而參與細(xì)胞因子的產(chǎn)生、免疫細(xì)胞的募集和激活以及適應(yīng)性反應(yīng)的啟動(dòng)等活動(dòng)[4]。研究顯示，抑制JAK2/STAT3 通路能夠抑制NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥體激活，從而改善缺血性腦卒中損傷和神經(jīng)炎癥[5]。燈盞細(xì)辛注射液（EBI）是由燈盞花素干燥制成的含黃酮類和咖啡酸類化合物的中藥注射劑，具有祛風(fēng)散寒、活血止痛的功效，主要用于治療心臟和肝臟疾病[6]。研究顯示，EBI 也能夠降低腦缺血再灌注模型大鼠的腦梗死率，也可以通過維持神經(jīng)元線粒體形態(tài)的穩(wěn)定性在缺血性卒中中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，具有起效快、時(shí)效長等特點(diǎn)[7-8]。但其對(duì)缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究甚少。因此，本研究旨在探索EBI 對(duì)缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量250～280 g，將大鼠放置在透明的籠子中，在12 h光/12 h 暗交替循環(huán)，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%下飼養(yǎng)，所有大鼠均可自由獲取食物和水。本研究獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2022-039）。

1.2 主要試劑及儀器 燈盞細(xì)辛注射液（規(guī)格：10 mL，云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z53021569）；尼莫地平注射液（規(guī)格：0.2 mg/mL，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20084238）；AG490 、Coumermycin A1（CA1 ，美國Med Chem Express，貨號(hào)：HY-12000、HY-N7452）；2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G3005）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、尼氏（Nissl）染色液（貨號(hào)：C0105S、C0117，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：40308ES20，上海翌圣生物科技股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）ELISA 檢測(cè)試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司，貨號(hào)：YK-08006、YK-09134）；丙二醛（MDA）ELISA 檢測(cè)試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)：SBJ-R0007）；Bax、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 兔單抗及B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、GAPDH兔多抗（英國abcam 公司，貨號(hào)：ab32503、ab108596、ab32101、ab68153、ab32143、ab196495、ab9485）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔（和元李記生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)AP31L014）；DXS-3 倒置生物顯微鏡（上海帝倫光學(xué)儀器有限公司）；XKDG001 倒置熒光顯微鏡（深圳市西尼科光學(xué)儀器有限公司）；Multiskan FC 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技）；ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)有限公司）。

1.3 大鼠腦卒中模型制備 將大鼠適應(yīng)性飼喂1 周后，均腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，并固定在立體定位架上，然后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=105），實(shí)驗(yàn)組大鼠利用大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）建立大鼠模型[9]：仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ICA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ECA），在CCA/ECA 的分叉處用5-0 線進(jìn)行結(jié)扎，在距CCA/ECA 分叉約0.5 cm 處的CCA 上開1 個(gè)小切口，將尼龍單絲從CCA 插入，經(jīng)過ICA 到達(dá)大腦中動(dòng)脈，在動(dòng)脈夾處結(jié)扎CCA 以防出血。2 h 后，抽出尼龍單絲恢復(fù)血流。假手術(shù)組大鼠只暴露頸動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎。手術(shù)期間使用加熱毯使大鼠保持恒溫，手術(shù)24 h 后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分在1～3 分之間則視為造模成功。

1.4 分組及給藥 將造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組、尼莫地平組、EBI 組、JAK2 抑制劑組（AG490 組）、EBI+JAK2 激動(dòng)劑組（EBI+CA1 組），每組20 只。尼莫地平組大鼠按0.5 mg/kg 的劑量腹腔注射陽性藥物尼莫地平注射液[7]，EBI 組大鼠按5 mL/kg 的劑量腹腔注射EBI[7]，JAK2 抑制劑組大鼠腹腔注射6 μL、20 nmol/mL 的JAK2 抑制劑AG490[10]，EBI+JAK2 激動(dòng)劑組大鼠在腹腔注射5 mL/kg 的EBI 30 min 后再注射100 μg/kg 的JAK2 激動(dòng)劑CA1[11]，假手術(shù)組和模型組均以相同方式注射等體積的生理鹽水。24 h 后對(duì)各組大鼠再次進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 使用Zea-Longa 方法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0 分：表示沒有可見的神經(jīng)缺損；1 分：左前爪未能完全伸展，表示輕度神經(jīng)功能障礙；2 分：牽拉尾巴時(shí)單向轉(zhuǎn)圈，表示中度神經(jīng)功能障礙；3 分：容易向缺血側(cè)傾倒，表示嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙；4 分：意識(shí)減退，無法自主行走。

1.6 TTC 染色檢測(cè)大鼠腦梗死面積 神經(jīng)評(píng)分結(jié)束后，每組選取5 只大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后斷頸處死，取出完整的腦組織用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗，取部分腦組織（n=5）固定于4%多聚甲醛中，剩余組織全部置于-80 ℃冰箱中保存。10 min 后取部分（n=5）冷凍的腦組織，切成2 mm 的冠狀切片。將腦切片放入2% TTC 溶液中，在37 ℃下孵育20 min，隨后棄去TTC 溶液，用4%多聚甲醛固定切片24 h，然后進(jìn)行拍照，并使用Image J 軟件分析梗死面積。

1.7 HE 和Nissl 染色檢測(cè)大鼠腦組織的病理性形態(tài) 將1.6 中固定過夜的腦組織進(jìn)行石蠟包埋并切成5 μm 厚的薄片。隨后將石蠟切片分別用二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水洗滌后，將切片置于HE 染色液或Nissl 染色液中染色，30 min 后將腦切片用蒸餾水洗滌后，再用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂封片。使用倒置生物顯微鏡觀察缺血側(cè)神經(jīng)元損傷情況，并利用Image J 軟件分析神經(jīng)元數(shù)量，每張切片選取5 個(gè)區(qū)域計(jì)算均值。

1.8 TUNEL 染色檢測(cè)大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 取1.7 中石蠟切片，在二甲苯中脫蠟，在梯度乙醇中水化，然后用蒸餾水清洗后吸干水分。在樣本切片上滴加100 μL 蛋白酶K 工作液，室溫孵育20 min，再加入100 μL 平衡液孵育10 min。用蒸餾水洗滌后在切片上加入預(yù)先配制好的TUNEL 反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育1 h，清洗后加入DAPI 進(jìn)行核染5 min，清洗后用抗熒光猝滅的封片劑進(jìn)行封片。用熒光顯微鏡觀察染色情況并利用Image J 軟件計(jì)算凋亡率。凋亡率（%）=TUNEL 陽性細(xì)胞（紅色熒光）/總細(xì)胞（藍(lán)色熒光）。

1.9 ELISA 檢測(cè)大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 的水平 取1.6 中凍存的腦組織（n=5）置于冰上溶解，洗滌后吸干水分進(jìn)行稱質(zhì)量，然后加入預(yù)冷的PBS 研磨成勻漿，在4 ℃下，3 000 r 離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液。根據(jù)ELISA 試劑盒的操作步驟檢測(cè)待測(cè)上清液中SOD、GSH-Px 和MDA 的水平。

1.10 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá) 將剩余的腦組織（n=5）置于冰上溶解，并使用RIPA 裂解緩沖液勻漿，在4 ℃下以10 000 r的速度離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液即為提取的蛋白質(zhì)。用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后在每個(gè)泳道加入40 μg 蛋白質(zhì)用SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。隨后將膜置于含有5%脫脂奶粉的TBST 中封閉2 h，TBST 洗滌后與一抗（Bax、Bcl-2、STAT3、p-STAT3 比例1∶1 000，JAK2、p-JAK2 比例1∶5 000，GAPDH 比例1∶2 500） 在4 ℃下孵育過夜，將膜再次用TBST 洗滌后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500）在室溫下孵育1 h，最后用ECL 試劑盒顯色。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶，并利用Image J軟件量化蛋白表達(dá)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組之間比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用Tukey 事后檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBI 對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較（±s）Tab.1 Comparison of neurological deficit scores of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（分）假手術(shù)組 20 0.00±0.00模型組 20 2.57±0.16*EBI 組 20 0.54±0.04#尼莫地平組 20 0.60±0.05#AG490 組 20 0.58±0.04#EBI+CA1 組 20 2.11±0.13△

2.2 EBI 對(duì)各組大鼠腦梗死面積的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的腦梗死面積增大（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠的腦梗死面積減?。≒＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠的腦梗死面積增大（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 TTC 染色檢測(cè)各組大鼠腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarction area detected by TTC staining of rats in each group

表2 各組大鼠腦梗死面積的比較（±s）Tab.2 Comparison of cerebral infarction area of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 梗死面積（%）假手術(shù)組 5 0模型組 5 38.65±2.54*EBI 組 5 16.37±1.31#尼莫地平組 5 18.46±1.52#AG490 組 5 17.93±1.45#EBI+CA1 組 5 32.58±2.16△

2.3 EBI 對(duì)各組大鼠腦組織中神經(jīng)元損傷的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元排列規(guī)則，染色均勻；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)元退化，細(xì)胞排列不規(guī)則且間隙增大，細(xì)胞核縮小，神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠神經(jīng)元損傷減輕，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)恢復(fù)，神經(jīng)元數(shù)量增加（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠神經(jīng)元形態(tài)與模型組無顯著差異，神經(jīng)元數(shù)量減少（P＜0.05）。見表3 和圖2、圖3。

圖2 HE 染色檢測(cè)各組大鼠腦組織的病理學(xué)形態(tài)（×200）Fig.2 HE staining was used to detect the pathological morphology of brain tissue of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠神經(jīng)元數(shù)量的比較（±s）Tab.3 Comparison of the number of neurons in rats in each group（±s）

表3 各組大鼠神經(jīng)元數(shù)量的比較（±s）Tab.3 Comparison of the number of neurons in rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 神經(jīng)元數(shù)量（個(gè)）假手術(shù)組 5 98.63±8.24模型組 5 53.47±4.83*EBI 組 5 84.32±7.65#尼莫地平組 5 81.43±7.26#AG490 組 5 83.64±6.90#EBI+CA1 組 5 59.31±5.10△

2.4 EBI 對(duì)各組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見表4 和圖4。

圖4 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（×200）Fig.4 Detection of neuronal apoptosis in rats of each group by TUNEL staining(×200)

表4 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in rats of each group（±s）

表4 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of neuronal apoptosis rate in rats of each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 細(xì)胞凋亡率（%）假手術(shù)組 5 2.53±0.18模型組 5 42.17±2.37*EBI 組 5 12.98±1.14#尼莫地平組 5 15.72±1.23#AG490 組 5 14.39±1.20#EBI+CA1 組 5 37.60±1.87△

2.5 EBI 對(duì)各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490組大鼠腦組織中MDA 水平降低，SOD、GSH-Px 水平升高（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中MDA 水平升高，SOD、GSH-Px 水平降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of SOD，GSH-Px and MDA levels in brain tissue of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 和MDA 水平的比較（±s）Tab.5 Comparison of SOD，GSH-Px and MDA levels in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

MDA（mmol/mg）假手術(shù)組 5 134.68±9.37 58.34±4.86 1.23±0.08模型組 5 72.35±5.18* 26.63±2.17* 4.87±0.32*EBI 組 5 116.62±8.91# 49.71±4.62# 2.55±0.16#尼莫地平組 5 112.97±8.24# 48.98±4.51# 2.63±0.17#AG490 組 5 114.39±7.69# 49.12±3.82# 2.70±0.16#EBI+CA1 組 5 75.84±6.23△ 30.23±3.10△ 4.59±0.28△組別 動(dòng)物數(shù) SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）

2.6 EBI 對(duì)各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織中Bax 表達(dá)及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 升高，Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比，EBI 組、尼莫地平組和AG490 組大鼠腦組織中Bax 表達(dá)及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 降低，Bcl-2 表達(dá)升高（P＜0.05），且EBI 組與尼莫地平組和AG490 組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與EBI 組相比，EBI+CA1 組大鼠腦組織中Bax 表達(dá)及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3升高，Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖5 和表6。

圖5 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of Bax，Bcl-2，JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 in brain tissue of rats in each group

表6 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達(dá)的比較（±s）Tab.6 Comparison of Bax，Bcl-2 protein and p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 expression in brain tissue of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 表達(dá)的比較（±s）Tab.6 Comparison of Bax，Bcl-2 protein and p-JAK2/JAK2，p-STAT3/STAT3 expression in brain tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與EBI組比較，△P＜0.05。

p-STAT3/STAT3假手術(shù)組 5 0.96±0.07 0.99±0.08 0.21±0.01 0.17±0.01模型組 5 2.15±0.16* 0.28±0.01* 0.94±0.07* 0.89±0.06*EBI 組 5 1.24±0.09# 0.87±0.06# 0.32±0.02# 0.26±0.01#尼莫地平組 5 1.29±0.10# 0.83±0.05# 0.34±0.02# 0.30±0.02#AG490 組 5 1.26±0.10# 0.85±0.06# 0.35±0.03# 0.28±0.02#EBI+CA1 組 5 2.07±0.15△ 0.35±0.02△ 0.87±0.05△ 0.83±0.05△組別 動(dòng)物數(shù) Bax Bcl-2 p-JAK2/JAK2

3 討論

缺血性腦卒中是一種常見的急性腦血管疾病，主要是由缺血性血管的短暫或永久閉塞引起，可導(dǎo)致腦組織損傷、梗死甚至殘疾[12]。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)元死亡可發(fā)生在缺血性腦卒中后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，主要通過細(xì)胞凋亡或壞死發(fā)生。雖然給予重組組織纖溶酶原激活劑和血管內(nèi)介入可以恢復(fù)血流灌注，但缺血再灌注損傷可能導(dǎo)致神經(jīng)元活性下降，甚至導(dǎo)致更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[13]。目前，溶栓治療是通過在不可逆的神經(jīng)元死亡之前向腦組織提供再灌注來改善結(jié)果的最有效治療方法。然而，這種策略只能在發(fā)病后較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行才能有效改變?nèi)毖倪M(jìn)程[14]。因此，尋找一種有效的方法來預(yù)防缺血性神經(jīng)元損傷對(duì)于腦卒中治療是非常必要的。本研究利用MCAO 法建立缺血性腦卒中大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分高于假手術(shù)組，腦梗死面積大于假手術(shù)組，同時(shí)腦組織神經(jīng)元退化，細(xì)胞排列不規(guī)則且核縮小，神經(jīng)元數(shù)目低于假手術(shù)組，表明大鼠腦卒中模型復(fù)制成功。而EBI 干預(yù)后，大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分降低，腦梗死面積減小，神經(jīng)元損傷減輕，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)，神經(jīng)元數(shù)量增加，且EBI 組與陽性藥物尼莫地平組無顯著差異。揭示了EBI 能夠減輕缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能障礙，抑制大腦梗死和神經(jīng)元損傷。

腦缺血后的神經(jīng)功能損害歸因于各種病理生理事件，包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥、免疫功能障礙和血腦屏障損傷，其中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡對(duì)于缺血性腦卒中的病理生理學(xué)至關(guān)重要，涉及許多凋亡相關(guān)基因，包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax[10]。本研究通過TUNEL 染色和Western blot 發(fā)現(xiàn)，陽性藥物和EBI 干預(yù)后大鼠腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率小于模型組，Bax 蛋白表達(dá)低于模型組，Bcl-2 蛋白表達(dá)高于模型組，揭示了EBI 能夠抑制缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)元凋亡。除此之外，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是缺血性腦卒中腦損傷的關(guān)鍵致病機(jī)制，在再灌注期間，氧和葡萄糖水平異常升高會(huì)加劇氧化應(yīng)激和由于初始缺血而已經(jīng)發(fā)生的細(xì)胞死亡[15]。氧化應(yīng)激主要是由活性氧的過量產(chǎn)生引起的，該過程會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)過氧化來誘導(dǎo)MDA 等活性醛的產(chǎn)生，同時(shí)導(dǎo)致SOD、GSH-Px 等抗氧化酶表達(dá)減少，抗氧化防御系統(tǒng)失衡，引起更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元損傷[16]。本研究結(jié)果顯示，陽性藥物組和EBI 組大鼠腦組織中SOD、GSH-Px 活性高于模型組，MDA 水平低于模型組，表明EBI 能夠抑制缺血性腦卒中大鼠的氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減輕神經(jīng)元損傷。

據(jù)報(bào)道，JAK2/STAT3 信號(hào)通路是主要的細(xì)胞因子信號(hào)通路之一，該通路廣泛參與各種疾病的發(fā)展，包括免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血管生成、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥等[17]。研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3 激活會(huì)導(dǎo)致腦缺血永久神經(jīng)元損傷，而干擾JAK2/STAT3 信號(hào)通路可改善神經(jīng)功能[18]。因此，本研究探討了JAK2/STAT3 通路在EBI 改善腦卒中神經(jīng)元損傷中的作用，結(jié)果顯示，EBI 組大鼠腦組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 水平均低于模型組，且與JAK2 抑制劑AG490 組無顯著差異，揭示了EBI 能夠抑制腦卒中大鼠中JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活。接著又利用JAK2 激活劑CA1 進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，EBI對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用被消除，揭示了EBI 對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，EBI 可能通過抑制JAK2/STAT3 信號(hào)通路對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用。本研究為減輕缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷提供了新的藥物和理論依據(jù)。